卵巢上皮性腫瘤組織中DNA-PKcs、Ku70蛋白的表達變化及意義

由衛芝，申愛方，張 玲，趙新蕊

(聊城市人民醫院，山東聊城 252000)

卵巢原發性惡性腫瘤中以上皮性癌最常見，占60% ～90%［1］，有關其發病機理及發生、發展的基因學說眾多。DNA依賴蛋白激酶(DNA dependent protein kinase，DNA-PK)屬于磷脂酰肌醇-3蛋白激酶(PI3KK)家族，與基因穩定性有較為密切的關系，DNA-PK的催化亞單位(DNA-PKcs)及調節亞單位(Ku70)共同參與DNA損傷修復途徑［2］，此兩個亞基異常表達均可能使生物體的基因組完整性和細胞穩定性遭到破壞，引起細胞增殖和分化失控，導致腫瘤的發生。本研究通過免疫組化法檢測了DNAPKcs、Ku70蛋白在不同上皮性卵巢腫瘤組織中的表達情況，并分析了兩者在卵巢腫瘤發生、發展中的意義。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源 聊城市人民醫院有完整臨床和病理資料并行手術治療的上皮性卵巢癌石蠟包埋組織標本共63份，組織標本獲取時間為2008年1月～2011年12月。所有病例術前均根據診治方案并在患者知情同意下未行放、化療及激素治療，均經病理檢查確診，患者年齡18～72歲。根據國際婦產科聯盟FIGO2000年臨床分期標準上皮性卵巢癌Ⅰ～Ⅱ期41例、Ⅲ～Ⅳ 期22例，伴淋巴結轉移22例，并發腹水28例;組織分化程度為中高分化43例，低分化20例;組織病理類型為漿液性腺癌40例，黏液性腺癌23例。隨機選取同期良性上皮性卵巢腫瘤組織標本20份作為對照。

1.2 DNA-PKcs、Ku70蛋白的檢測 組織石蠟切片厚度4 μm，常規脫蠟至水，采用高壓煮沸法行抗原修復后按SP試劑盒(北京中杉生物技術有限公司提供)說明書檢測DNA-PKcs、Ku70蛋白表達 。一抗試劑為DNA-PKcs兔抗人多克隆抗體、Ku70兔抗人多克隆抗體(北京中杉金橋生物技術有限公司提供)，均按說明書要求配制，工作濃度1∶300，DAB顯色，蘇木素對比染色。以PBS緩沖液代替一抗做陰性對照，每批切片免疫組化染色分析均以已知陽性組織切片做陽性對照。染色結果判定標準:隨機選擇5個高倍視野，計數500個以上細胞，均以胞核著色判斷為陽性，對陽性細胞數及著色強度進行半定量，其中陽性細胞數為0計0分、1% ～30%計1分、31% ～70%計2分、71% ～100%計3分，細胞著色強度按照不著色、淺棕色、棕黃色、棕褐色依次計0、1、2、3分，上述兩項評分之和0分為陰性、1～2分為弱陽性(+)、3～4分為中陽性(++)、5～6分為強陽性(+++)，陽性率按中陽性和強陽性計算。

1.3 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件包。率的比較用χ2檢驗，DNA-PKcs和Ku70蛋白表達的關系分析采用Spearman等級相關分析法。P≤0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 兩種不同上皮性卵巢腫瘤組織中DNA-PKcs、Ku70蛋白的表達 上皮性卵巢癌和良性上皮性卵巢腫瘤組織中DNA-PKcs蛋白的陽性表達率分別為68.25%(43/63)、15.00%(3/20)，二者差異有統計學意義(P＜0.05)。上皮性卵巢癌和良性上皮性卵巢腫瘤組織中Ku70蛋白的陽性表達率分別為76.19%(48/63)、20.00%(4/20)，二者差異有統計學意義(P ＜0.05)。

2.2 DNA-PKcs、Ku70蛋白的表達與上皮性卵巢癌臨床病理參數的關系 DNA-PKcs蛋白表達與上皮性卵巢癌的病理學分級和手術病理分期相關(P＜0.05)，而與組織類型、腹水、淋巴結轉移情況無關(P＞0.05)。Ku70蛋白的表達與上皮性卵巢癌的手術病理分期、病理學分級、腹水及淋巴結轉移均相關(P ＜0.05)，與組織病理學類型無關(P ＞0.05)。詳見表1。

表1 DNA-PKcs、Ku70蛋白的表達與上皮性卵巢癌臨床病理參數的關系

2.3 上皮性卵巢癌組織中DNA-PKcs蛋白和Ku70蛋白表達的相關性 上皮性卵巢癌組織中DNAPKcs蛋白和Ku70蛋白表達呈正相關(r=0.619，P＜0.001)，詳見表2。

表2 上皮性卵巢癌組織中DNA-PKcs蛋白和Ku70蛋白表達的相關性(例)

3 討論

目前，卵巢癌發病原因不清，諸多研究表明多種基因在其發生中起協同作用［3］，DNA-PK因在DNA損傷修復中具有關鍵作用，近年來受到越來越廣泛的關注。DNA-PK包括催化亞單位DNA-PKcs和結構亞單位Ku70、Ku80組成的異二聚體全酶［4］。Ku異二聚體是DNA雙鏈斷裂(DNA doublestrand break，DSB)進行非同源性末端連接(Nonhomologous end joining，NHEJ)修復時啟動階段必須的酶，而DNA-PKcs發揮催化酶的活性，二者結合共同參與DNA 損傷修復途徑［5，6］。DNA 損傷修復啟動修復機制，是一種抑制癌癥發生的有效保護途徑，能夠使細胞免于凋亡或死亡。例如，對哺乳動物腫瘤細胞DNA所致損傷進行及時修復有助于腫瘤細胞免于死亡。研究表明，在惡性腫瘤中普遍存在DNA-PK表達變化，許多腫瘤細胞均可見DNA-PK復合物的高表達［7～9］。有研究認為，卵巢癌組織中細胞的DNA修復能力增強，DNA-PKcs在卵巢良性腫瘤組織中的表達低于卵巢癌組織［10］。本實驗研究結果支持上述觀點，提示DNA-PKcs可能通過抑制癌細胞凋亡在卵巢癌的發生、發展中起重要作用，此基因對于鑒別卵巢腫瘤的良惡性生物學行為有一定指導意義。為進一步深入了解不同卵巢組織中的DNAPKcs表達水平，本研究用免疫組化的方法進行檢測，并結合臨床病理參數進行分析，結果顯示DNAPKcs與上皮性卵巢癌的分化程度及臨床分期有關。提示DNA-PKcs的異常表達與腫瘤的惡性程度及進展有一定關系，此與Hosoi等［11］的研究結果一致。Ku70最早發現于多發性肌炎綜合征患者自身抗原，是完成NHEJ途徑DNA-PK的重要因子之一。由于其功能的多樣性及復雜性，近年來與腫瘤的相關性研究逐漸引起關注。

Ku70的高表達與多種腫瘤的發生、發展有關。國內外研究發現，Ku70的表達水平在腫瘤及原發灶之間存在顯著差異，明顯強于正常組織，并與腫瘤的侵潤性、分期和轉移灶有關［12］。Economopoulou等［13］通過Western Blotting方法檢測了Ku70在成人骨髓異常增生綜合征組織中的表達，結果發現核型預后較好患者的Ku70表達率低;Mazzarelli等［14］發現，Ku70在正常直腸黏膜組織表達中較弱，在直腸癌組織中的表達顯著增強。本研究顯示，上皮性卵巢癌組織中Ku70蛋白的陽性表達率顯著高于良性上皮性卵巢腫瘤組織，且其表達與上皮性卵巢癌組織學類型無關，與臨床分期、病理學分級、腹水、淋巴結轉移均有關，與諸多文獻報道相似。表明Ku70的表達與上皮性卵巢癌的發生、發展及惡性程度相關，此在婦科其他惡性腫瘤中也有論證。張妍等［15］的研究表明，Ku70的表達與宮頸癌組織分化程度相關，Ku70蛋白高表達者組織分化程度差、惡性程度高，此亦表明Ku70的過度表達在腫瘤的進展過程中起一定作用。故檢測Ku70蛋白表達對于間接判斷腫瘤患者的治療效果及預后可能有重要指導意義，下調Ku70蛋白的表達水平將成為抗癌治療的新方向。本研究還顯示，DNA-PKcs、Ku70在上皮性卵巢癌組織中的表達呈正相關。可能機制:DNAPKcs與Ku70均為DNA-PK的重要亞基，二者在細胞DSB修復過程中發揮重要的協同作用。

綜上所述，DNA-PKcs、Ku70蛋白高表達可能在上皮性卵巢癌發生、發展及轉移中發揮協同作用，且有可能成為上皮性卵巢癌早期診斷、預后判斷的新指標及治療靶點。

［1］張羽，沈鏗.卵巢上皮性癌篩查的研究進展［J］.中華婦產科雜志，2003，38(2):115-116.

［2］Lieber MR，Ma Y，Pannicke U，et al.Mechanism and regulation of human non-homologous DNA end-joining［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2003，4(9):712-720.

［3］Alshenawy HA.Immunohistochemical expression of epidermal growth factor ceceptor，E-cadherin，and matrix metalloproteinase-9 in ovarian epithelial cancer and relation to patient deaths［J］.Ann Diagn Pathol，2010，14(6):387-395.

［4］Lieber MR，Gu J，Lu H，et al.Nonhomologous DNA end joining(NHEJ)and chromosomal translocations humans［J］.Subcell Biochem，2010，(50):279-296.

［5］Costantini S，Woodbine L，Andreoli L，et al.Interaction of the Ku heterodimer with the DNA ligaseⅣ/Xrcc4 complex and its regulation by DNA-PK［J］.DNARepair(Amst)，2007，6(6):712-722.

［6］Budman J，Chu G.Processing of DNA for nonhomologous end-joining by cell free extract［J］.EMBO J，2005，24(4):849-860.

［7］Elliott SL，Crawford C，Mulligan E，et al.Mitoxantrone in combination with an inhibitor of DNA-dependent protein kinase:a potential therapy for high risk B-cell chronic lymphocytic leukaemia［J］.Br J Haematol，2011，152(1):61-71.

［8］Kase M，Vardja M，Lipping A，et al.Impact of PARP-1 and DNA-PK expression on survival in patients with glioblastoma multiforme［J］.Radiother Oncol，2011，101(1):127-131.

［9］Tian X，Chen G，Xing H，et al.The relationship between the down-regulation of DNA-PKcs or Ku70 and the chemosensitization in human cervical carcinoma cell line HeLa［J］.Oncol Rep，2007，18(4):927-932.

［10］Boldogh I，Roy G，Lee MS，et al.Reduced DNA double strand breaks in chlorambucil resistant cells are related to high DNA-PKcs activity and low oxidative stress［J］.Toxicology，2003，193(1-2):137-152.

［11］Hosoi Y，Watanable T，Nakagawa K，et al.Up-regulation of DNA-PK activity and SP1 in colorectal caneer［J］.Int J Oncol，2004，25(2):461-468.

［12］Pucci S，Mazzarelli P，Rabitti C，et al.Tumor specific modulation of Ku70/80 DNA binding activity in breast and bladder human tumor biopsies［J］.Oncogene，2001，20(6):739-747.

［13］Economopoulou P，Pappa V，Kontsioti F，et al.Expression analysis of proteins involved in the non homologous end joining DNA repair mechanism，in the bone marrow of adult de novo myelodysplastic syndromes［J］.Ann Hematol，2010，89(3):233-239.

［14］Mazzarelli P，Parrella P，Seripa D，et al.DNA end binding activity and Ku70/80 heterodimer expression in human colorectal tumor［J］.World J Gastroenterol，2005，11(42):6694-6700.

［15］張妍，鞠桂芝，張士平，等.Ku70在宮頸癌組織中的表達及意義［J］.中國婦幼保健，2009，24(12):1700-1702.