結(jié)直腸腺癌組織中FLNa、VEGF表達(dá)與微淋巴管密度的關(guān)系及意義

馬紅獻(xiàn)，史建偉，張利眾，劉勤英，李 中

(1 淶源縣醫(yī)院，河北保定 074300;2河北大學(xué)附屬醫(yī)院;3 保定市第一醫(yī)院)

結(jié)直腸腺癌是常見(jiàn)的胃腸道惡性腫瘤，局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是患者預(yù)后較差的重要原因，淋巴道是轉(zhuǎn)移的重要途徑。細(xì)絲蛋白A(Filamin A，F(xiàn)LNa)是肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白家族成員之一，我們的前期研究表明其與結(jié)直腸腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［1］。本研究采用免疫組化法檢測(cè)了FLNa、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和淋巴管特異性標(biāo)志物D2-40在結(jié)直腸腺癌組織及正常結(jié)直腸組織中的表達(dá)情況，以進(jìn)一步探討 FLNa、VEGF的表達(dá)及微淋巴管密度(Lymphatic microvessel density，LMVD)與結(jié)直腸腺癌發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本收集 標(biāo)本為河北大學(xué)附屬醫(yī)院2005年1月～2006年12月結(jié)直腸腺癌手術(shù)切除癌組織(標(biāo)本均取自腫瘤中心處)及其相應(yīng)癌旁正常結(jié)直腸組織(標(biāo)本取于距腫瘤邊緣至少10 cm處)各46份。46例結(jié)直腸腺癌患者中男27例，女19例;年齡34～80歲，平均58歲。診斷均經(jīng)病理證實(shí)，無(wú)其他部位原發(fā)腫瘤，術(shù)前無(wú)放、化療及免疫生物治療史。其中結(jié)腸腺癌17例、直腸腺癌29例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移33例、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移13例，有肝轉(zhuǎn)移9例、無(wú)肝轉(zhuǎn)移37例，浸潤(rùn)深度達(dá)漿膜30例、未達(dá)漿膜16例。

1.2 FLNa、VEGF和D2-40的檢測(cè) ①免疫組化采用鏈霉親和素—生物素—過(guò)氧化物酶檢測(cè)步驟(免疫組化試劑盒及單克隆鼠抗人D2-40一抗購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;單克隆兔抗人FLNa一抗購(gòu)自Epitomics公司;單克隆鼠抗人VEGF一抗購(gòu)自Santa Cruz公司):組織標(biāo)本采用10%中性甲醛固定、石蠟包埋，切成4 μm厚切片，經(jīng)脫蠟、水化，置入盛有枸櫞酸緩沖液的容器內(nèi)，于微波爐內(nèi)(95℃，15 min)修復(fù)抗原，3%過(guò)氧化氫孵育20 min，PBS溶液沖洗，使用免疫組化試劑盒中的血清封閉，滴加兔抗人 FLNa一抗(1∶150)、鼠抗人 VEGF一抗(1∶100)和鼠抗人 D2-40一抗(1∶100)，4 ℃冰箱內(nèi)過(guò)夜;PBS溶液沖洗，滴加免疫組化試劑盒內(nèi)生物素標(biāo)記的相關(guān)二抗，置于室溫30 min;PBS溶液沖洗，滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素，置于室溫30 min，PBS溶液沖洗，DAB顯色，自來(lái)水沖洗，蘇木精染色、脫水，二甲苯透明，樹(shù)膠封片。人子宮組織染色作為FLNa蛋白的陽(yáng)性對(duì)照，人乳腺癌組織染色作為VEGF蛋白的陽(yáng)性對(duì)照，人扁桃體組織染色作為D2-40蛋白的陽(yáng)性對(duì)照，PBS溶液代替一抗進(jìn)行染色作為陰性對(duì)照。②FLNa、VEGF表達(dá)及LMVD計(jì)數(shù)判定:FLNa和VEGF的陽(yáng)性表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)，在高倍鏡下選擇5個(gè)視野計(jì)數(shù)，每個(gè)高倍視野下計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞≤10%為1分、11% ～50%為2分、51% ～75%為3分，≥76%為4分;細(xì)胞質(zhì)無(wú)色為0分、黃色為1分、棕黃色為2分、棕褐色為3分。上述兩分值的乘積＞3分判為陽(yáng)性，≤3分判為陰性。D2-40陽(yáng)性表達(dá)定位于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的胞質(zhì)和(或)胞膜，呈清晰棕黃色顆粒，用于標(biāo)記并計(jì)數(shù)LMVD。LMVD計(jì)數(shù)采用Weidner等［2］的方法，先在40倍顯微鏡下觀察整張切片的血管分布，選擇脈管最密集的4個(gè)區(qū)域(熱點(diǎn)區(qū))，在200倍顯微鏡下觀察，其中著色的細(xì)胞叢或單個(gè)細(xì)胞計(jì)為1條微淋巴管，取其均值為該組織切片的LMVD。由2名臨床病理醫(yī)師分別獨(dú)立閱片，共同確定判定結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料比較用t檢驗(yàn)、單因素方差分析，計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法進(jìn)行相關(guān)檢驗(yàn)，相關(guān)關(guān)系分析用Spearman相關(guān)分析法。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸腺癌組織及其癌旁正常組織中FLNa、VEGF的表達(dá)及LMVD 結(jié)直腸腺癌組織中FLNa陽(yáng)性22例(47.83%)、VEGF 陽(yáng)性41 例(89.13%)，癌旁正常組織中分別為 42例(91.30%)、15例(32.61%)，兩種組織中FLNa、VEGF陽(yáng)性表達(dá)率比較均有顯著差異(P均=0.000);結(jié)直腸腺癌組織及其癌旁正常組織中的 LMVD分別為(17.32±2.12)、(4.36 ±1.21)條，P=0.001。

2.2 結(jié)直腸腺癌組織中FLNa、VEGF表達(dá)及LMVD與腫瘤臨床病理參數(shù)的關(guān)系 結(jié)直腸腺癌組織中FLNa、VEGF的表達(dá)及LMVD值與有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移及癌灶的浸潤(rùn)深度有關(guān)，而與年齡、性別及癌灶的部位無(wú)關(guān)，詳見(jiàn)表1。

2.3 結(jié)直腸腺癌組織中FLNa、VEGF表達(dá)及LMVD三者間的相關(guān)性 結(jié)直腸腺癌組織22例FLNa表達(dá)陽(yáng)性者中，VEGF表達(dá)陽(yáng)性18例、陰性4例;24例FLNa表達(dá)陰性者中，VEGF表達(dá)陽(yáng)性23例、陰性1例，F(xiàn)LNa和VEGF的表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.445，P=0.000)。FLNa 表達(dá)陽(yáng)性和陰性者的 LMVD 分別為(3.24 ±0.57)、(16.23 ± 3.64)條，P=0.001;VEGF表達(dá)陽(yáng)性和陰性者的LMVD分別為(15.65 ±1.26)、(2.94 ±0.61)條，P=0.000。

3 討論

腫瘤微淋巴管與腫瘤生長(zhǎng)、局部浸潤(rùn)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移關(guān)系密切［3］。腫瘤細(xì)胞經(jīng)淋巴管轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制尚不完全明確，但研究表明腫瘤細(xì)胞發(fā)生淋巴道轉(zhuǎn)移時(shí)微淋巴管數(shù)量增多［4］。研究淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的分子標(biāo)志物包括VEGFR-3、Desmoplakin、LYVE-1、Podoplanin、D2-40、Prox-1 及 CD34等［5］。一項(xiàng)對(duì)比研究證實(shí)，D2-40對(duì)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞具有較高的敏感性［6］。本研究中使用D2-40標(biāo)記微淋巴管、檢測(cè)LMVD，結(jié)果證實(shí)結(jié)直腸腺癌組織中的LMVD顯著高于癌旁正常結(jié)直腸組織，并且與有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移及癌灶的浸潤(rùn)深度有關(guān)。

表1 結(jié)直腸腺癌組織中FLNa、VEGF的表達(dá)及LMVD與腫瘤臨床病理參數(shù)的關(guān)系

微淋巴管的形成及增殖受諸多因素的調(diào)節(jié)，多種血管生成促進(jìn)因子可促進(jìn)微淋巴管的生長(zhǎng)，如VEGF、內(nèi)皮素-1和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子等［7］。而內(nèi)皮抑素、干擾素-α和血小板因子-4等可抑制淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡，從而抑制微淋巴管的生成［8］。對(duì)腫瘤微淋巴管生長(zhǎng)進(jìn)行抑制可有效阻遏腫瘤細(xì)胞經(jīng)淋巴道擴(kuò)散。FLNa是主要存在于細(xì)胞質(zhì)的大分子蛋白，是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的支架蛋白，影響多種重要受體在細(xì)胞內(nèi)的功能發(fā)揮，參與多條與腫瘤形成相關(guān)的主要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在腫瘤的形成及發(fā)展中具有重要作用［9］。VEGF是具有生物活性的糖蛋白，能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、增強(qiáng)毛細(xì)血管的通透性，并誘導(dǎo)形成淋巴管［10］。Zhu等［11］發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LNa與VEGF結(jié)合經(jīng)泛素化后可使VEGF降解。本研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸腺癌組織中的FLNa陽(yáng)性表達(dá)率顯著低于癌旁正常結(jié)直腸組織，而VEGF陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于癌旁正常結(jié)直腸組織，兩者均與腫瘤有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移及癌灶的浸潤(rùn)深度有關(guān)，均與患者年齡、性別無(wú)明顯相關(guān);FLNa與VEGF在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)，F(xiàn)LNa表達(dá)陽(yáng)性者的LMVD顯著低于FLNa表達(dá)陰性者，VEGF表達(dá)陽(yáng)性者的LMVD顯著高于VEGF表達(dá)陰性者。提示FLNa、VEGF的表達(dá)水平和LMVD與結(jié)直腸腺癌的形成、發(fā)展密切相關(guān)，其機(jī)制可能為FLNa通過(guò)下調(diào)VEGF的表達(dá)水平抑制腫瘤微淋巴管生長(zhǎng)，最終抑制腫瘤細(xì)胞經(jīng)淋巴道擴(kuò)散。

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