尿毒癥患者血清對血管平滑肌細胞鈣化及Ⅰ型膠原表達的影響

白亞玲，徐金升，牛哲哲，張俊霞，張勝雷，崔立文，張慧然

(河北醫科大學第四醫院，石家莊 050011)

近年來，慢性腎臟病(CKD)已成為我國常見的慢性疾病，患病率約為 10.8%［1，2］，并有逐年增高的趨勢。國外統計結果表明，CKD患者是心血管疾病(CVD)發生的高危人群，而血管鈣化作為CVD發生的獨立危險因素，近年研究顯示，CKD患者主要表現為中膜鈣化，血管平滑肌細胞(VSMCs)發生類成骨/成軟骨樣表型轉化，在血管鈣化中起著極為重要的作用。2011年1月～2012年9月，我們采用尿毒癥患者血清(以下簡稱尿毒癥血清)模擬體內環境刺激VSMCs，用不同濃度尿毒癥血清對VSMCs進行干預，探討尿毒癥血清誘導VSMCs鈣化的機制。

1 材料與方法

1.1 材料 選取2011年1月～2012年9月于河北醫科大學第四醫院血液凈化中心行維持性血液透析的患者12例，正常健康志愿者10例，自河北醫科大學實驗動物中心購置清潔級SD大鼠數只，雄性，5周齡，體質量80～100 g。

1.2 試劑與儀器 兔抗鼠Ⅰ型膠原多克隆抗體(美國Abcom公司)、熒光標記抗兔的二抗(Cell signaling公司)、RT-PCR反轉錄試劑盒(美國Fermentas公司)、凝膠成像系統FOTODYNE型(美國Image公司)、PCR儀ABI5700型(美國ABI公司)、微量核酸蛋白檢測儀(美國Thermo公司)、穩壓穩流電泳儀DYY-III6B(北京六一儀器廠)。

1.3 方法

1.3.1 取大鼠胸腹主動脈采用組織塊貼壁法進行VSMCs原代培養，所有細胞均采用高磷(10 mmol/L β-甘油磷酸)培養基培養，VSMCs隨機分為健康血清組和尿毒癥血清組，依據血清在培養基中所占比例每組各設5%、10%、15%(低、中、高)三個亞組，干預6 d。

1.3.2 血清制備 尿毒癥血清組:透析前清晨空腹采靜脈血4 mL離心后，分離血清并混合，56℃滅活，0.22 μm的濾膜過濾除菌，－80℃冷凍保存備用;健康血清組:同期選取自愿參與本研究的健康志愿者，清晨空腹采靜脈血4 mL，處理方法同尿毒癥患者血清。依據血清在培養基中所占比例每組各設5%、10%、15%(低、中、高)三個亞組，分別干預 6 d。

1.3.3 鈣化檢測

1.3.3.1 鈣鹽沉積測定 ①茜素紅染色［3］:取4～5代細胞以5×104/孔密度接種于24孔板內，干預6 d，用pH 8.4、濃度為0.1%的茜素紅染液進行鈣化染色，倒置顯微鏡下觀察照相。結果判斷標準:鈣鹽沉積為橘紅色。②von Kossa染色［4］:同法接種細胞，干預后固定，行5%硝酸銀避光行鈣化染色，紫外線照射。倒置顯微鏡下觀察照相。結果判斷標準:鈣鹽沉積為黑色，背景為紅色。

1.3.3.2 細胞內鈣含量測定［4］取4～5代細胞以2 ×105/孔密度接種于6 孔板，干預6 d，0.6 mmol/L鹽酸37℃脫鈣24 h，吸取上清，鈣定量檢測試劑盒測定鈣含量，脫鈣后的細胞用0.1 mol/L NaOH和0.1%的 SDS 溶解細胞 30 min，BCA 法［3］測定細胞蛋白含量，結果用細胞鈣含量比蛋白含量表示(g/mg蛋白)。實驗每組設3個復孔。

1.3.4 細胞核心結合因子 α1(Cbfα1)mRNA 及 I型膠原(ColⅠ)mRNA測定 細胞總RNA提取采用Trizol一步法。引物序列由Primer 5.0軟件設計(Cbfα1:forward primer:5'-CCGCACGACAACCGCACCAT-3'，Reverse primer:5'-CGCTCCGGCCCACAAATCTC-3';CoIⅠ:forward primer:5'-GGTTTGGAGAGAGCATGACC-3'，Reverseprimer:5'-TTTGGGGAAAT-3'GAGTTTGG-3';GAPDH:forward primer:5'-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3'，Reverse primer:5'-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3')。應用反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)進行檢測。實驗重復3次，以GAPDH作為內對照，計算Cbfα1 mRNA及ColⅠmRNA相對含量。

1.3.5 細胞及上清液ColⅠ蛋白的測定 提取細胞及上清液中總蛋白［5］，應用Western blot法進行檢測。一抗采用兔抗ColⅠ抗體(1∶1000)或兔抗GAPDH抗體(1∶1000)，二抗為熒光標記的抗兔的抗體(1∶10000)，結果采用gel-Image J軟件進行分析，實驗重復3次，以GAPDH作為內對照，計算ColⅠ蛋白相對含量。

1.4 統計學方法 采用SPSS13.0統計學軟件，符合正態分布的計量資料用()表示，兩組間均數比較用t檢驗，多組間均數比較采用單因素方差分析(ANOVA)，用S-N-K檢驗作多組間均數兩兩比較，相關分析符合雙變量正態分布作Pearson積差相關分析，不符合雙變量正態分布作Spearman秩相關分析。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 VSMCs鈣化測定 茜素紅染色及von Kossa染色示:與健康血清組比較，尿毒癥血清組VSMCs鈣化染色均加重，隨尿毒癥血清濃度增高，鈣化結節越明顯。VSMCs鈣沉積測定示:與健康血清組比較，尿毒癥血清組鈣含量均增高，5%濃度開始升高，15%濃度達最高，呈現濃度依賴性(P＜0.05)。見表1。

2.2 Cbfa1 mRNA表達 與健康血清組比較，尿毒癥血清組Cbfα1 mRNA表達均升高(P＜0.05)。尿毒癥血清組低、中、高三個亞組間兩兩比較，Cbfα1 mRNA表達差異均有統計學意義，趨勢上5%濃度開始升高，15%濃度達最高，亦呈濃度依賴性(P＜0.05)。見圖1，表2。

表1 不同血清刺激對血管VSMCs鈣含量的影響(μg/mg 蛋白，)

表1 不同血清刺激對血管VSMCs鈣含量的影響(μg/mg 蛋白，)

注:與健康血清組比較，﹟P＜0.05;與同組5%濃度比較，△P＜0.05;與同組10%濃度比較，▲P ＜0.05

組別 鈣含量尿毒癥血清組5%濃度 109.39 ±10.14﹟10%濃度 134.22 ± 4.90﹟△15%濃度 165.35 ±14.06﹟△▲健康血清組5%濃度 76.16 ± 2.3210%濃度 78.11 ± 2.3715%濃度76.55 ± 3.52

圖1 不同濃度血清刺激后對VSMCs Cbfα1 mRNA表達的影響

表2 不同濃度血清刺激后對VSMCs Cbfα1 mRNA 表達的影響()

表2 不同濃度血清刺激后對VSMCs Cbfα1 mRNA 表達的影響()

注:與健康血清組比較，﹟P＜0.05;與同組5%濃度比較，△P＜0.05;與同組10%濃度比較，▲P ＜0.05

組別 Cbfα1 mRNA尿毒癥血清組5%濃度 0.288 ±0.010﹟10%濃度 0.387 ±0.020﹟△15%濃度 0.427 ±0.020﹟△▲健康血清組5%濃度 0.223 ±0.02010%濃度 0.235 ±0.02015%濃度0.238 ±0.010

2.3 ColⅠmRNA及蛋白表達 與健康血清組比較，尿毒癥血清組細胞ColⅠmRNA、細胞上清液中ColⅠ蛋白表達均升高，低、中、高三個亞組間呈現濃度依賴性，組間比較差異有統計學意義(P＜0.05)。尿毒癥血清組低、中、高三個亞組間比較結果見表3。同時檢測發現健康血清組及尿毒癥血清組細胞中均無ColⅠ蛋白表達。見圖2、3。

圖2 不同濃度血清刺激后對VSMCs ColⅠmRNA表達的影響

圖3 不同濃度血清刺激后對VSMCs上清液中ColⅠ蛋白表達的影響

表3 不同濃度血清刺激對VSMCs ColⅠmRNA及上清液中ColⅠ蛋白表達的影響()

表3 不同濃度血清刺激對VSMCs ColⅠmRNA及上清液中ColⅠ蛋白表達的影響()

注:與健康血清組比較，﹟P＜0.05;與同組5%濃度比較，△P＜0.05;與同組10%濃度比較，▲P ＜0.05

組別 ColⅠ mRNA ColⅠ 蛋白尿毒癥血清組5%濃度 0.682±0.010﹟ 0.651±0.02﹟10%濃度 0.719±0.030﹟△ 0.752±0.03﹟△15%濃度 0.910 ±0.020﹟△▲ 0.843 ±0.03﹟△▲健康血清組5%濃度 0.564 ±0.020 0.278 ±0.02010%濃度 0.595 ±0.040 0.399 ±0.04015%濃度0.598 ±0.040 0.509 ±0.080

2.4 尿毒癥血清組VSMCs鈣化、ColⅠ表達、Cbfα1表達的相關性 尿毒癥血清組低、中、高三個亞組VSMCs鈣含量與上清液中ColⅠ蛋白表達均呈正相關(r=0.797，P ＜0.01)，細胞 ColⅠ mRNA 表達與Cbfα1 mRNA 表達亦呈正相關 (r=0.784，P ＜0.05)。

3 討論

CKD患者的血管鈣化主要表現為中膜鈣化，位于血管中膜的血管平滑肌細胞在CKD患者血管鈣化中起著關鍵作用［6］。以前人們普遍認為CKD患者血管鈣化是一種鈣磷被動沉積于細胞和組織間的過程，而近年來證實，血管鈣化是一個細胞介導的、主動的、高度可調的生物學過程，類似于骨和軟骨的骨化過程，其鈣化發生的中心環節是血管平滑肌細胞向成骨/成軟骨樣表型轉化，然后啟動的一系列異位成骨的過程［7］，最終導致包括血管在內的全身軟組織發生礦化、鈣化。本研究采用尿毒癥血清模擬體內環境，對VSMCs進行刺激，分別用茜素紅及von Kossa兩種鈣化染色方法證實尿毒癥血清刺激可加重VSMCs鈣化，使鈣結節數目增加，具有典型細胞鈣化的特征，與文獻［8］報道一致，且尿毒癥血清刺激可使鈣含量升高。本研究發現，尿毒癥血清可促進鈣化發生、發展，且尿毒癥血清濃度越高，鈣化越嚴重，提示臨床上CKD患者隨時間延長CVD發生風險增高，可能與體內毒素水平升高誘導血管鈣化有關。

成骨樣細胞表型特征的鈣化是血管鈣化的結構基礎，核心結合因子(Cbfα1/Runx2)作為成骨樣細胞表型的標記物，是骨形成過程中的主要調節因子［9］，其是三個核心結合因子家族中的成員之一，另外兩個成員為 Cbfα2、Cbfα3［10］。但 Cbfα1 不是成骨細胞所特有，其在發生鈣化的血管平滑肌細胞中也表達［11］。本研究發現，尿毒癥血清刺激VSMCs后細胞內Cbfα1 mRNA表達升高，呈現濃度依賴性，提示尿毒癥患者血清干預VSMCs后誘導其發生表型轉化，VSMCs成骨/成軟骨樣表型轉化在血管鈣化中可能發揮重要作用。

骨分子生物研究顯示，骨基質形成的過程在某種程度上伴隨ColⅠ累積的礦化發生過程［12］，ColⅠ作為細胞外基質的最主要組成成分，約占血管壁膠原成分的60%，屬于“間隙膠原”，其成分改變對血管鈣化的發生發展起重要作用。ColⅠ在骨礦化中的作用主要表現為:一是穩定細胞基質的作用;二是隨細胞的ColⅠ量的積累，形成大量的類骨質，為礦化作準備，而ColⅠ在VSMCs中亦可能發生相似過程誘導鈣化發生。研究證實VSMC由收縮型轉化為合成型時，其對ColⅠ的合成能力大大加強，提示尿毒癥血清可以誘導VSMCs表型轉化進而分泌ColⅠ，從而使細胞保持一個穩定的狀態，利于細胞外基質結構的形成，進一步發生礦化［13］。本研究采用尿毒癥血清模擬體內環境，對VSMCs進行刺激，對細胞內及細胞上清液 ColⅠ分別進行檢測，發現VSMCs內無ColⅠ蛋白表達，上清液可檢測到ColⅠ蛋白表達，提示尿毒癥血清刺激后VSMCs內ColⅠ蛋白含量升高，呈濃度依賴性，進一步證實ColⅠ屬于分泌性蛋白。細胞鈣含量變化與ColⅠ蛋白表達相關分析顯示二者呈正相關，提示ColⅠ在誘導VSMCs鈣化中發揮作用，與目前研究相一致［14］。本研究同時發現尿毒癥患者血清刺激VSMCs后細胞內Cbfα1 mRNA及ColⅠ mRNA表達呈正相關，與目前關于Cbfα1可以正向調節成骨細胞特定ColⅠ蛋白基因的表達［15］的研究相一致。已知Cbfα1屬于runt結構域基因家族，通過runt與DNA結合，可以調節成骨分化標志基因和成骨表型相關基因的表達，進一步促進骨分化和骨形成。

綜上所述，不同濃度尿毒癥患者血清刺激可使VSMCs發生鈣化，其作用機制可能是通過VSMCs表型轉化，促使ColⅠ蛋白表達升高。

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