發酵豆制品中轉基因成分的熒光定量P C R研究

焦新萍，曾金紅，鄭云峰，江濤，李博斌，王路雯，諸葛慶，李巖冰，黃曉麗，曾紅燕

（紹興市質量技術監督檢測院，國家黃酒產品質量監督檢驗中心，浙江紹興 312071）

發酵豆制品中轉基因成分的熒光定量P C R研究

焦新萍，曾金紅，鄭云峰，江濤，李博斌，王路雯，諸葛慶，李巖冰，黃曉麗，曾紅燕

（紹興市質量技術監督檢測院，國家黃酒產品質量監督檢驗中心，浙江紹興 312071）

摘 要：以FAM和BHQ1兩種熒光素分別標記為報告染料和淬滅染料，建立了轉基因發酵豆制品中抗草甘膦轉基因EPSPS、大豆凝集素Lectin基因的Taqman熒光PCR定量檢測體系，檢測靈敏度為0.1%，重現性良好，特異性強，可作為發酵豆制品轉基因成分定量檢測的供選方法。在霉千張和臭腐乳（青方乳）等發酵豆制品中檢出抗草甘膦轉基因成分。

關鍵詞：發酵豆制品；轉基因；熒光定量PCR；TaqMan探針

隨著轉基因食品的商品化生產，其安全性越來越受到關注。目前全球已有65個國家和地區對轉基因產品實行強制性標識管理制度，少部分國家或地區實行自愿標識制度。澳大利亞、巴西、挪威、日本、韓國等國家和地區的轉基因產品標簽制度，要求食品中轉基因成分含量超過1%，2%或5%的必須實施標簽，而歐盟的要求閾值更加嚴格，由原來的1%（1997年）提高到0.9%（2003年）[1-3]。越來越多的研究表明轉基因食品存在巨大的健康隱患[4-7]，然而，很多商家在利益驅動下對食品中轉基因成分隱而不報，為維護消費者權益、保障消費者的知情權、食品中轉基因成分檢測技術的研究和調查工作顯得極為必要。

傳統發酵豆制品包括腐乳、黃豆醬、豆鼓、醬油、霉千張等，因其味道獨特，滋味鮮美，深受消費者的喜愛。發酵豆制品不但風味獨特，還具有許多特殊的營養保健功能，如其抗氧化、降血壓、溶血栓等[8-9]。霉千張（霉千張筒）是利用毛霉等微生物發酵千張而制成的豆制品，通常表面有一層白色的毛霉菌絲，因而得名，其中以湖北和浙江較普遍生產。

抗草甘膦Roundup Ready大豆含有外源花椰菜花葉病毒CaMV35S啟動子、抗草甘膦5-烯酮丙酮酸莽草酸-3-磷酸酶基因（5-enolpyruvylshimate-3-phosphate synthase gene，EPSPS基因）、胭脂堿合酶終止子NOS[2]。大豆持家基因植物凝集素基因（lectin）在細胞中的表達量或在基因組中的拷貝數是恒定的，受環境因素影響較小，在轉基因大豆產品檢側中被用作衡量基因組DNA提取數量和質量的指標[10]。

實時熒光定量PCR是普通PCR技術上發展起來的最新定量檢測技術，具有靈敏性高、特異性強、結果精確等優點，廣泛應用于分子生物學和食品檢測等多個領域[11]。

本試驗以FAM和BHQ1兩種熒光素分別標記為報告染料和淬滅染料，建立發酵豆制品轉基因成分的高通量Taqman實時熒光定量PCR檢測方法；開展發酵豆制品的轉基因成分調查工作，為加強對發酵食品轉基因成分標簽的管理提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

5%（質量分數，下同）轉基因大豆Roundup Ready（RR）標準品，非轉基因 RR 大豆（陰性對照）（Fluka）；CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）、CCl4、異戊醇、無水乙醇、乙酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）等試劑為分析純。待檢固態發酵豆制品霉千張（霉千張筒）、臭豆腐、黃豆醬、腐乳從市場上任意選購。

熒光定量PCR預混液Premix Ex TaqTM（Perfect Real Time）、引物及TaqMan探針合成來自大連寶生物工程有限公司，引物及TaqMan探針序列如表1所示。

表1 熒光定量PCR的引物及Taqman探針序列Table 1 Primers and Taqman probe sequences of Quantitative PCR

1.2 主要儀器與設備

LightCycle 480Ⅱ實時熒光定量PCR儀：瑞士Roche公司；高速冷凍離心機：上海天美生化儀器設備工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA的提取方法

大豆及發酵豆制品中基因組DNA的提取方法參照文獻[12]。

1.3.2 重復性試驗（穩定性試驗）

以轉基因成分含量為1.0%的轉基因大豆為試驗樣品對大豆內源持家基因凝集素Lectin進行連續4次的重復擴增，以確定熒光定量PCR檢測的穩定性。

1.3.3 檢測低限的確定（靈敏度的確定）

將5%Round Ready（RR）轉基因大豆標準品與非轉基因大豆陰性對照按一定比例混合配制成5.0%、2.0%、1.0%、0.5%、0.1%準含量的轉基因大豆，提取基因組DNA，進行外源靶基因的定量PCR反應，做3次重復，得到相應的Ct值。將能夠得到擴增的含轉基因成分最低的百分含量定為本方法的檢測低限。

1.3.4 相對定量曲線的制定

采用相對定量法（ΔCt與轉基因百分含量的對數值）：對含量分別為0.1%、0.5%、1.0%、2.0%、5.0%的5種轉基因大豆混合樣品分別擴增Lectin和EPSPS基因，以轉基因大豆樣品百分含量的對數值（log x%）為縱坐標，以轉基因大豆樣品的ΔCt值（EPSPS擴增得到的Ct1和Lectin擴增得到的Ct2之差）為橫坐標，做成相對定量曲線，求得相對定量方程，把待測樣品得到的ΔCt值代入定量方程計算出樣品中轉基因大豆成分的含量。

1.3.5 熒光定量PCR反應體系及條件

反應體系：按照反應總體積為25μL，內含2*Premix Ex TaqTM10 μL，上、下游引物（10 μmol/L）、探針（5 μmol/L）各 1.25 μL，模板各 4 μL，配制實時熒光定量PCR反應體系。

反應條件：變性：95℃，5 min；循環擴增（45個循環）：95℃15 s，60℃45 s。

1.3.6 對發酵豆制品樣品進行檢測

應用建立的TaqMan熒光定量PCR方法，對每個樣品重復2次，并設立無菌雙蒸水（空白）、轉基因大豆RR樣品（陽性）和非轉基因大豆（陰性）3個對照。

2 結果與分析

2.1 重復性試驗

提取到一定數量的高質量的基因組DNA是進行轉基因成分定量PCR擴增的前提條件。大豆的內源持家凝集素Lectin基因是單拷貝的，受環境因素影響較小，通過擴增Lectin基因，可以判斷所提取的DNA是否適合于PCR擴增，從而避免假陰性結果的出現。

為驗證熒光PCR檢測結果的可重復性，以Lectin基因為靶序列，對同一轉基因大豆的核酸為模板做4個重復，擴增結果見圖1，4次擴增曲線基本吻合。

圖1 轉基因大豆持家凝集素Lectin基因的熒光定量PCR擴增曲線Fig.1 Amplified Curve of Lectin in genetically modified soybean by Quantitative PCR

由圖1可以看出模板DNA均能正常擴增，其擴增曲線為“S”型特征形狀。空白對照無擴增，表明樣品DNA的純度較好且操作過程中無污染；4次重復測定的Ct值分別為21.52、21.94、21.67和21.45，變異系數小，為1.0%，如表2所示，表明熒光PCR檢測方法有較高的可重復性。

表2 Taqman熒光定量PCR檢測轉基因大豆Lectin基因的重復性Table 2 Repeatability of ct-vlaues of Lectin in soybean by quantitative PCR

2.2 檢測低限的確定（靈敏度）

由于轉基因原料在收獲、運輸及加工等過程中可能與非轉基因作物發生混雜，不同國家也分別頒布了關于轉基因作物的混合下限。本試驗以轉基因大豆為原料，將轉基因陰性大豆和RR大豆，按照表4所列比例混合，這樣得到不同比例的混合大豆樣品后抽提基因組DNA，以EPSPS基因為目標基因檢測熒光定量PCR的靈敏度，擴增曲線如圖2所示。

圖2 轉基因大豆外源插入基因EPSPS的熒光定量PCR擴增曲線Fig.2 Amplified Curve of exogenous EPSPS in genetically modified soybean by Quantitative PCR

2.3 相對定量曲線的建立

在熒光定量PCR中，循環參數（Ct值）和PCR體系中起始DNA量的對數值之間有嚴格的線性關系，可推出循環參數之差ΔC（t）與兩個基因終濃度的比值之間也有嚴格的線性關系，因而可以采用相對定量法（ΔCt與轉基因百分含量的對數值）來建立定量方程：以ΔCt值（EPSPS擴增得到的Ct1和Lectin擴增得到的Ct2之差）為橫坐標，轉基因百分含量的對數值（logx%）為縱坐標，繪制相對定量曲線。轉基因含量的對數值（logx%）及Lectin、EPSPS基因的Ct值及ΔCt值及如表3所示。

表3 轉基因大豆實時熒光定量PCR擴增結果Tab.3 Ct-vlaues of EPSPS and Lectin in genetically modified soybean by Quantitative PCR

圖3是EPSPS基因與Lectin基因的ΔCt對轉基因含量得到的曲線圖，ΔCt與轉基因含量對數值（logx%）的定量方程為：y=-0.303 9x+1.431 9，其中y為轉基因樣品百分比含量的對數值，x為相應樣品中外源基因EPSPS和內源基因lectin之間的ΔCt值，相關系數R2=0.991 4，表明線性關系良好。

圖3 轉基因大豆含量的相對定量曲線Fig.3 The relative quantification Curve of content of genetically modified soybean

2.4 霉千張、臭腐乳等發酵豆制品中轉基因成分的檢測

從市場上任意挑選了36個不同的樣品，按“1.3.1”方法進行處理后測定，通過Taqman熒光定量PCR擴增大豆內源凝集素Lectin基因以及目的基因EPSPS、CaMV35S啟動子、NOS終止子，它們的擴展曲線分別如圖4、圖5、圖6和圖7所示，對應的Ct見表4。

圖4 霉千張中大豆內源Lectin基因的熒光定量PCR擴增曲線Fig.4 Amplified Curve of Lectin from soybean in Qian Zhang by Quantitative PCR

表4 霉千張、腐乳等發酵豆制品中轉基因成分的高通量檢測Table 4 High-throughout detection of genetically modified component in fermented soybean products such as mildew Qian Zhang and bean curd

圖5 霉千張中外源插入CaMV35S基因的熒光定量PCR擴增曲線Fig.5 Amplified Curve of exogenous CaMV35S in Qian Zhang by Quantitative PCR

圖6 霉千張中外源插入EPSPS基因的熒光定量PCR擴增曲線Fig.6 Amplified Curve of exogenous EPSPS in Qian Zhang by Quantitative PCR

圖7 霉千張干中外源插入基因NOS的熒光定量PCR擴增曲線Fig.7 Amplified Curve of exogenous NOS in Qian Zhang by Quantitative PCR

從實驗結果表4來看，內源基因和外源插入目的基因擴增的Ct值均小于36，表明提取的DNA質量較好，在35個樣品中，有6個樣品檢出含有抗草甘膦轉基因成分，含量范圍從0.32%到1.38%。

3 結論與討論

本實驗以FAM和BHQ1兩種熒光素分別標記為報告染料和淬滅染料，建立了轉基因發酵豆制品中EPSPS抗草甘膦轉基因、大豆凝集素Lectin基因的Taqman熒光PCR定量檢測體系，檢測靈敏度為0.1%，特異性強，重現性良好。在霉千張和臭腐乳（青方乳）中檢出抗草甘膦轉基因成分。

轉基因作物作為直接原料加工的食品與普通原料加工食品一樣要經過若干加工工序，食品加工過程中的溫度變化、酶活性、PH值高低和發酵生產過程都會對蛋白質和核酸造成嚴重破壞，給DNA的提取造成一定的困難[13-14]。因此優質高效的DNA提取方法是食品中轉基因成分的定量檢測的前提和關鍵。本研究采用改良的CTAB法對霉千張（霉千張筒）、黃豆醬、腐乳等發酵豆制品中的基因組DNA進行提取，試驗結果表明提取的DNA質量較好，可用于定量PCR反應。此外，針對深加工食品DNA易降解的情況，試驗中引物擴增片段均很短，并以基因組中的單拷貝基因大豆lectin基因作為內源參照基因，首先通過PCR檢測驗證相應DNA的質量以減少假陰性結果的出現。

本研究采用FAM和BHQ1兩種熒光素分別標記為報告染料和淬滅染料的Taqman探針實時定量PCR技術，利用相對定量法在樣品霉千張（霉千張筒）、腐乳（青方乳）、黃豆醬等發酵豆制品中檢出轉基因成分，其含量均大于轉基因成分規定的底限0.1%，表明上述發酵豆制品被檢樣品都有抗草甘膦轉基因成分。有研究報道豆鼓、醬油等發酵豆制品中檢出轉基因成分[12，14-16]。

從市售霉千張、腐乳結果來看，內源基因和外源插入目的基因擴增的Ct值均小于36，表明提取的DNA質量較好，在35個樣品中，有6個樣品檢出含有抗草甘膦轉基因成分，含量范圍從0.32%到1.38%，而其他29個樣品中沒有檢測到抗草甘膦轉基因成分，有可能這些發酵豆制品的制作原料是非轉基因大豆,或摻入的轉基因大豆比例很小,或是其他品系的轉基因大豆；其次,也有可能一些發酵豆制品中的DNA是痕量的,提取的基因組DNA量太少,擴增信號很弱或沒有擴增信號；第三發酵豆制品中殘留DNA的量與發酵過程中所用的微生物種類、發酵程度等導致DNA降解有關,發酵時間越長、加工過程越復雜、微生物酶解作用越強可能導致DNA的降解越嚴重,損失也就越大。對比發現,黃豆醬中的轉基因成分含量較高,而霉千張、腐乳中的轉基因成分含量較低,這可能與原料大豆本身轉基因成分含量的高低、制作過程中的發酵程度、工藝等密切相關。

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Detection of Genetically Modified Ingredient in Mildew Qian Zhang and Smelly Bean Curd by Fluorescent Quantitative PCR

JIAO Xin-ping，ZENG Jin-hong，ZHENG Yun-feng，JIANG Tao，LI Bo-bin，WANG Lu-wen，ZHUGE Qing，LI Yan-bing，HUANG Xiao-li， ZENG Hong-yan
（Shaoxing Testing Institute of Quality Technical Supervision，National Center for Quality Supervison and Testing of Rice Wine，Shaoxing 312071，Zhejiang，China）

Abstract：With FAM and BHQ1 two fluorescent labeled reporter dye and a quencher dye， the detection system was established about EPSPS （5-enolpyruvylshimate-3-phosphate synthase gen） and Lectin （soybean keeping gene）in fermented soy products by Taqman fluorescent quantitative PCR，the sensitivity was 0.1%，and reproducibility is good.Because of its good repeatability， specificity and reliability， TaqMan probe method is extremely adequate for the quantitative detection of genetically modified component in fermented soy products.The genetically modified EPSPS were firstly detected in mildew Qian Zhang and smelly bean curd fermented soy products.

Key words：fermented soy products；transgene；fluorescence quantitative PCR；TaqMan probe

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2013.13.022

國家質檢總局科技項目(2010QK321)

焦新萍（1980—），女（漢），工程師，碩士，研究方向：分析化學。

2012-10-11