超聲-UPLC法測定補骨脂中補骨脂素和異補骨脂素

李凱，牛樂，李赫宇，賈利利，張振凌，*

（1.河南中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，河南鄭州 450008；2.天津市益倍建生物技術(shù)有限公司，天津 300457）

超聲-UPLC法測定補骨脂中補骨脂素和異補骨脂素

李凱1，牛樂1，李赫宇2，賈利利1，張振凌1，*

（1.河南中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，河南鄭州 450008；2.天津市益倍建生物技術(shù)有限公司，天津 300457）

摘 要：補骨脂是我國用于生產(chǎn)各種保健品的傳統(tǒng)原料之一，其主要活性成分為補骨脂素和異補骨脂素。本實驗改進中國藥典補骨脂項下補骨脂素和異補骨脂素含量測定方法。采用C18ODS色譜柱（1.8 μm，4.6 mm×50 mm），流動相乙腈-水（35∶65），流速0.5 mL/min，檢測波長246 nm，測定藥典法和超聲法制備補骨脂供試品溶液中補骨脂素和異補骨脂素含量。5 min內(nèi)補骨脂素、異補骨脂素分離良好。在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)2種化合物的線性關(guān)系良好，r＞0.999 7；精密度RSD≤2%；平均加樣回收率為＞99%。超聲法與索氏提取法相比無顯著性差異（P＞0.05）。該方法操作簡便，節(jié)省時間和溶劑，為補骨脂中補骨脂素、異補骨脂素的分析提供了一種簡便快速的新手段。

關(guān)鍵詞：補骨脂；補骨脂素；異補骨脂素；超聲法

補骨脂為豆科植物補骨脂Psoralea corylifolia L.的干燥成熟果實[1]，具有溫腎助陽、納氣、止瀉的功效。目前補骨脂廣泛應(yīng)用于各種獨具功能的營養(yǎng)保健品的生產(chǎn)。研究證明補骨脂素和異補骨脂素具有抗氧化，促進皮膚色素增生，抗腫瘤活性，抗病毒和影響代謝的作用，是獨具功能的營養(yǎng)因子[2-3]。

2010版中國藥典收錄的補骨脂含量測定用樣品的制備方法為索氏提取法，流動相為甲醇-水（45∶55）[1]，該方法操作復(fù)雜，耗時較長，不利于大量樣品的分析。超高效液相色譜（UPLC）分析速度更快，流動相使用更省，廣泛應(yīng)用于分析領(lǐng)域的食品、藥品、環(huán)境等樣品檢測。本文采用超聲-UPLC法改進中國藥典色譜方法，并測定比較了超聲法和藥典法制備補骨脂供試品溶液含量。

1 儀器及試藥

LC-20型高效液相色譜儀（UV檢測器）：日本島津）；MettlerAE240型十萬分之一電子天平：德國梅特勒公司；Sartorius BS210S型萬分之一電子天平：德國賽多利斯。

補骨脂素對照品（中國藥品生物制品檢定所，110739-200814）；異補骨脂素對照品（中國藥品生物制品檢定所，110738-201012）；乙腈（Dikmapure，HPLC）；雙蒸水。

補骨脂藥材來源見表2。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：安捷倫-C18ODS色譜柱（1.8 μm，4.6 mm×50 mm）；流動相：乙腈-水（35∶65）；流速 0.5 mL/min；檢測波長246 nm；柱溫：30℃；進樣量2 μL。

2.2 對照品溶液的制備

十萬分之一天平精密稱取經(jīng)五氧化二磷干燥的補骨脂素、異補骨脂素適量，置10 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻即得濃度分別為186 μg/mL和190 μg/mL的對照品混合儲備液。

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 藥典法供試品溶液的制備

取本品粉末（過三號篩）約0.5 g，精密稱定，置索氏提取器中，加甲醇50 mL，加熱回流提取2 h，放冷，轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.2 超聲法供試品溶液的制備

取本品粉末（過三號篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率 100 W，頻率 40 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液1 mL，置5 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4 線性關(guān)系考察

分別吸取對照品混合儲備液適量，由高至低依次用甲醇稀釋至標準曲線所需6個濃度，以補骨脂素、異補骨脂素峰面積為縱坐標，補骨脂素、異補骨脂素質(zhì)量濃度為橫坐標，繪制標準曲線，其回歸方程分別為Y=2731.3X-79.4，r=0.999 9；Y=3 926.3X-1 047.2，r=0.999 7。補骨脂素在 1.86 μg/mL～186 μg/mL，異補骨脂素在 1.90 μg/mL～190 μg/mL 與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5 儀器精密度試驗

取同一份混合對照品溶液，按2.1項下色譜條件在同1天內(nèi)連續(xù)重復(fù)進樣5次，測得日內(nèi)精密度。再取同一份混合對照品溶液按上述色譜條件連續(xù)3 d重復(fù)進樣2次，測得日間精密度。以峰面積計算，補骨脂素和異補骨脂素的日內(nèi)RSD分別為1.08%和1.34%；日間RSD分別為1.92%和1.47%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗

精密稱取同一批次樣品6份，按2.3.2項下方法分別提取，按2.1項下色譜條件分析測定。補骨脂素和異補骨脂素的平均質(zhì)量分數(shù)分別為0.62%和0.30%，RSD分別為0.98%和1.03%，樣品重復(fù)性良好。

2.7 中間精密度試驗

以在不同日期、不同實驗人員按2.3.2項下方法制備6份供試品溶液，對同一樣品分別測定。測得補骨脂素和異補骨脂素的平均質(zhì)量分數(shù)分別為0.62%和0.30%，RSD分別為1.32%和1.57%，該方法的中間精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗

將樣品按2.3.2項下方法制備成供試品溶液，分別于 0、2、4、8、12、24 h 進行測定，結(jié)果表明，補骨脂素和異補骨脂素在24 h內(nèi)穩(wěn)定，其含量的RSD分別為2.19%和1.77%。

2.9 回收率試驗

精密稱取6份已知含量的藥材粉末0.5 g，精密加入補骨脂素和異補骨脂素對照品適量，同2.3項下方法制備供試品溶液。結(jié)果補骨脂素和異補骨脂素平均加樣回收率分別為99.14%和99.27%，RSD分別為1.43%和1.20%，見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果Table 1 Results of recovery test

2.10 結(jié)果

分別精密稱取不同批次的8個補骨脂商品藥材樣品粉末各6份，每份0.5 g，分別按照2.3.1項下制備藥典法供試品溶液和2.3.2項下制備超聲法供試品溶液，測定峰面積，其典型色譜圖見圖1，根據(jù)標準曲線計算其含量，見表2。

圖1 補骨脂素和異補骨脂素典型色譜圖Fig.1 Typical chromatograms of psoralen and isopsoralen

表2 藥典法和超聲法制備樣品的含量測定結(jié)果（n=3）Table 2 Determination of different parts samples by pharmacopoeia and ultrasonic method

采用配對t檢驗，計算t0.05/2（7）＜2.364 6，即P＞0.05，說明藥典法與超聲法所測定的補骨脂中補骨脂素和異補骨脂素含量無顯著性差異。

3 討論

2010版中國藥典[1]收錄的制備補骨脂供試品溶液的方法為索氏提取法，該方法操作復(fù)雜，過程繁瑣，對操作者要求較高，且供試品溶液制備時間長達2 h。而本實驗所采用的超聲法提取時間只需0.5 h，大大縮短了時間。

也有文獻報道，可采用微波萃取法作為補骨脂供試品溶液的方法[4]。但目前微波萃取設(shè)備尚不成熟，該方法相比超聲法來講，適用性就顯得較差。因此，從簡便操作，節(jié)約時間，方法適用性的角度考慮，我們認為目前超聲法是替代操作繁瑣的索氏提取法最佳方法。

同時，本實驗還改進了色譜條件，采用粒度更小的快速分離高通量色譜柱，在流速0.5 mL/min情況下，分離時間由藥典方法的15 min左右縮短為5 min，即節(jié)省溶劑，又縮短分析時間，有利于大量樣品的分析。

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[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].一部.北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:174

[2]吳少華,張仲海,趙建斌.補骨脂素體內(nèi)外抗癌活性的實驗研究[J].中國中藥雜志,1998,23(5):303-306

[3]郭秀芝,劉衛(wèi)萍,楊杰.補骨脂的藥理活性及其開發(fā)利用[J].中醫(yī)藥學(xué)報,2005,33(5):52-53

[4]盧彥芳,安靜,蔣曄.微波萃取快速分析補骨脂中補骨脂素和異補骨脂素[J].中國中藥雜志,2011,36(9):1158-1161

Determination of Psoralen and Isopsoralen in Psoralea corylifolia by Ultrasonic-UPLC

LI Kai1，NIU Le1，LI He-yu2，JIA Li-li1，ZHANG Zhen-ling1，*
（1.Henan College of Traditional Chinese Medicine，Zhengzhou 450008，Henan，China；2.Tianjin Ubasichealth Nutrition Co.，Ltd.，Tianjin 300457，China）

Abstract：To improve the Chinese pharmacopoeia method for determination ofPsoralea corylifolia.C18ODS column （1.8 μm， 4.6 mm × 50 mm）was adopt，the mobile phase was composed of acetonitrile and water（35∶65）at flow rate of 0.5 mL/min，detective wavelength was 246 nm.Psoralen and isopsoralen in test solution prepared by pharmacopoeia and ultrasonic method was determined.Psoralen and isopsoralen was well separated in 5 min.The two kinds of compounds was well linear correlated within corresponding concentration range，r＞ 0.999 7；RSD≤2%；average recovery＞99%.There is no significant difference between ultrasonic method and Soxhlet extraction.The method significantly saved analysis time and solvent， and provided a simple， fast means for determination of psoralen and isopsoralen.

Key words：Psoralea corylifolia；psoralen；isopsoralen；ultrasonic method

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2013.13.023

河南中醫(yī)學(xué)院博士基金項目（BSJJ2010-06）

李凱（1982—），男（漢），講師，博士，研究方向：中藥炮制與中藥制劑相關(guān)性研究。

張振凌（1957—），女（漢），教授，本科，研究方向：中藥炮制學(xué)教學(xué)與研究工作。

2013-02-18