應用多重PCR方法鑒定蔬菜水果中的芽孢桿菌

岳鵬

（天津市食品研究所有限公司，天津 301609）

應用多重PCR方法鑒定蔬菜水果中的芽孢桿菌

岳鵬

（天津市食品研究所有限公司，天津 301609）

摘 要：建立的多重PCR方法與16S rDNA序列作為模板對細菌的分型鑒定具有較好的特異性，可快速準確鑒定芽孢桿菌的4個種屬，在微生物檢測方面有良好的實用前景。

關鍵詞：芽孢桿菌；多重PCR；16S rDNA

實驗室最常見的檢測方法是根據菌體、菌落的特征和其生物化學反應來進行鑒定。而面對表型特征不很明顯時很容易導致錯判的現象，并且生化反應耗時耗力，往往需要數天時間才能完成。目前開發很多的試劑盒，如API和BIOLOG快速鑒定系統，測定步驟繁瑣、成本高不能夠滿足快速、準確檢測的需要。

1985年，Kary Mullis發明了PCR技術，PCR技術發展至今已延伸出很多不同種的變體，例如：遞減PCR、逆轉錄PCR、熱啟動PCR、即時PCR、巢式PCR、多重PCR等。PCR反應是模仿細胞內發生的DNA復制過程，在體外由酶催化合成的特異性DNA片段。雙鏈DNA在高溫的作用下可以變性成單鏈，在有DNA聚合酶的參與下，根據堿基互補配對原則對目標基因進行復制，當DNA的溫度降低后又可以復性為雙鏈。因此，通過控制溫度的變化以達到DNA的變性和復性，加入合理設計的引物，DNA聚合酶和dNTP就可以完成特定基因的體外復制[1]。近年來隨著核酸技術的發展，PCR技術16S rDNA常被用于細菌鑒定核糖體。16S rDNA基因序列全長約1 550 bp，是由交替的保守區和可變區組成，利用保守段和可變段組成設計的引物，可以確定其菌屬以及同種菌屬不同菌株的類別[2]。本文利用多重PCR技術，以最常見致病的芽孢桿菌為目的菌株，分離提純出其16S rDNA為模板進行特異性擴增，PCR產物經NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中BLAST進行序列的比對，確定其細菌的種屬。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

試驗所用的蔬菜和水果選購自市場；PCR套裝試劑盒（dNTPs、buffter、Taq 酶、Mg2+）：鑫國昌（北京）生物技術有限責任公司；限制性內切酶：郝佳（上海）科技發展有限公司；PCR引物的合成：杰瑞（北京）生物工程有限公司。

GeneAmp9700 PCR儀：美國應用生物系統公司；低溫冷凍高速離心機：德國Eppendorf公司。

1.2 方法與PCR體系的建立

1.2.1 芽孢桿菌的提取與提純

浸泡在7.5%氯化鈉溶液中，再加熱至90℃保持2 min，冷卻后制成幾個不同的10倍稀釋液，分別進行平板涂布培養，分離的細菌經過革蘭氏染色在顯微鏡下分離出芽孢桿菌23株（編號1-22）。

1.2.2 DNA的提取與提純

16S rDNA的提取。細菌經24 h富集培養后，于5 500 r/min離心10 min，棄上清，沉淀物加入200 μL TE緩沖液、200 μL裂解液和0.5 g小玻璃珠，在振蕩器上以4 000 r/min的速度擊打1 min，反復3次。勻漿以12 000 r/min離心15 min，收集上清備用。上清液經氯仿和70%乙醇洗滌數次，保存在-20℃的TE緩沖液中。提取出的DNA經紫外分光光度計OD260/OD280進行DNA的純度檢測。

1.2.3 PCR反應體系的建立

擬用40 μL的反應體系，其中包括：0.2 μmol/L的特異性引物、3.75mmol/LMgCl2、200μmol/L 的 dNTP、5U Taq DNA聚合酶、1x PCR緩沖液和1 μg DNA模板。PCR引物模板選自文獻[3-4]中的特異性引物，見表1。

表1 特異性引物模板Table 1 Primers for specific PCR

PCR反應循環為94℃1min；65℃90s，72℃2min；72℃for 10 min.反應循環為35次。產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 PCR產物測序

對擴增的DNA序列測序由上海生工生物工程技術服務有限公司完成。測序結果分析由BioEdit Sequence Alignment Editor（Version 7.0.5.3）軟件操作。測序結果與菌株之間的相似度比對由NCBI’s BLAST（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）軟件進行。

2 結果與討論

2.1 PCR產物的分析

以22株芽孢桿菌DNA為模板進行PCR擴增，其產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳在紫外燈下檢測結果顯示如圖1。

圖1 以22株芽孢桿菌的基因組DNA為模板的多重PCR擴增結果Fig.1 The multiplex PCR amplification of other representative strains using 16s rDNA as template

PCR產物的大小由NCBI blast軟件完成預先的判定。B.subtilis的產物為256 bp、B.licheniformis的產物為356bp、B.pumilus為 321bp、B.cereus為 736bp。PCR 產物經凝膠電泳結果符合實驗預期，1-5號為B.subtilis、13-18 號為B.licheniformis、19-22 號為B.pumilus、6-12號為B.cereus。限制性內切酶EcoRI選擇用來對其中7、9、11號進行限制性內切酶實驗，進一步確定其為B.cereus.結果經由 NEB cutter 2.0（http：//tools.neb.com/NEBcutter2/index.php）軟件預測，其產物大小為兩段，分別為230 bp和599 bp。7、9、11號PCR產物經限制性內切酶EcoRI實驗，產物于1.2%凝膠電泳檢測結果見圖2。

圖2 7、9、11號芽孢桿菌經限制性內切酶實驗凝膠電泳圖Fig.2 PCR products after digested with restriction enzyme（EcoRI）.1.2%agarose gel

2.2 PCR產物的序列分析

對分離出的芽孢桿菌菌株的特異PCR產物進行測序，結果通過GenBank中BLAST比對，與數據庫中的同一區段核酸序列的同源性達到：枯草芽孢桿菌100%、地衣芽孢桿菌100%，蠟狀芽孢桿菌100%，結果說明各特異性引物具有很強的保守性、特異性和忠實性。分離的22株芽孢桿菌分別為1-5號為B.subtilis、13-18 號為B.licheniformis、19-22 號為B.pumilus、6-12號為B.cereus。

3 結論

本文中用到的PCR方法可以為芽孢桿菌特別是蠟狀芽孢桿菌的檢測提供快速準確的技術支持。雖然多重PCR方法在微生物檢測上做到快速、準確的優勢，但是也有與其他一些芽孢菌發生交叉反應的可能[5]以常規方法與分子生物學技術結合，可取得事半功倍的效果。

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[1]楊文敏,何敏．PCR擴增16S-23S rRNA區間序列在細菌檢測與鑒定領域的應用[J]．廣西預防醫學,2000,6(6):369

[2]Kolbert C P,Persing D H.Ribosomal DNA sequencing as a tool for identification of bacterial pathogens[J].Curr Opin Microbiol,1999,2(3):299-305

[3]Kolusheva T,Marinova A.A Study of the Optimal conditions for starch hydrolysis through thermostable α-AMYLASE[J].Journal of the university of chemical technology and metallurgy,2007,42(1):93-96

[4]曹鳳明,沈德龍,李俊,等.應用多重PCR鑒定微生物肥料常用芽孢桿菌[J].微生物學報,2008,48(5):651-656

[5]Buchanan R E,Gibbons N E.伯杰細菌鑒定手冊[M].8版.中國科學院微生物研究所《伯杰細菌鑒定手冊》翻譯組，譯.北京:科學出版社,1984:78-88

Application of Muti-PCR for Identification of Bacillus spp.in Vegetable and Fruit

YUE Peng
（Institute of Tianjin Food Co.，LTD.，Tianjin 301609，China）

Abstract：The rapid and accurate method established with multiplex PCR with high specificity as a template using 16S rDNA sequence for identification of the fourBacillus spp.

Key words：Bacillus spp.；Muti-PCR；16S rDNA

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2013.13.027

岳鵬（1985—），男（漢），助理工程師，碩士，從事微生物PCR鑒定工作。

2013-06-18