生產純凈水廢水培養螺旋藻技術

趙文越，王雪青，何曉萍

（天津市食品與生物技術重點實驗室天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津 300134）

螺旋藻[1-2]是地球上最古老的原核光合生物，迄今已有35億年的生命史，是目前發現的營養最豐富、最均衡的天然綠色食品，有“微型綠色營養庫”之稱。然而，螺旋藻是一種淡水藻，需要大量的淡水對其培養，而日益短缺的淡水資源限制其生產規模。

利用廢水養殖螺旋藻不僅降低其生產成本，更重要的是對環境友好。20世紀70年代以來，國外就有利用沼氣池廢水、城市廢水、二級處理廠廢水以及繅絲、印染、制藥、釀造、制糖、制革等工業有機廢水養殖螺旋藻等微藻并使廢水得以凈化的報道[3-6]。國內也有關于利用糖蜜、酒精、啤酒廢液對螺旋藻實施培養的研究。廢水來源不同，重金屬等有毒物質的含量也不同。生產食品級螺旋藻只能采用無毒或低毒廢水，而對于飼料或工業級螺旋藻可適當放寬要。

近年純凈水產量急劇上升，伴其而生的廢水也急劇增加。這些廢水倒入河流，不僅造成浪費，而且改變河流的鹽度，影響環境。純凈水生產廢水含有一定量的無機物（C、N、P源）和各種金屬離子，這些無機物為螺旋藻的生長提供基本營養條件。經過適當調節，就能利用這些廢水生產高價值的螺旋藻。

研究不同營養條件下，利用純凈水生產廢水培養螺旋藻，旨在為利用純凈水生產廢水培養螺旋藻提供有益的參考數據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藻種

鈍頂螺旋藻869藻株:天津商業大學生物工程專業實驗室獲得。

1.1.2 廢水

純凈水的生產廢水：天津商業大學品佳水中心提供。

1.2 主要實驗儀器

DDSJ-308A型臺式電導率儀、7230G型分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；FD-2型密封式恒溫可調電加熱器：金壇市瑞華儀器有限公司；SN510C型高壓蒸汽滅菌鍋：重慶雅馬拓科技有限公司；HPG-280BX光照培養箱：北京中科浩宇科技發展有限公司；DG-202-3型電熱恒溫干燥箱：天津市天宇實驗儀器有限公司。

1.3 測定方法

1.3.1 pH的測定

精密pH試紙法。

1.3.2 電導率的測定

電導率儀法。

1.3.3 藻的培養與生物量的測定

取一瓶對數生長期的鈍頂螺旋藻培養液，搖勻，按照10%體積比的接種量接入廢水培養基與AB培養基中，放在HPG-280BX光照培養箱培養。培養條件：光照溫度為24.8℃，光照強度為4 000 lx，光暗周期為12 h∶12 h。每天觀察藻種生長狀態，560 nm處測定培養液OD值。培養不同時間的藻液，取一定體積，抽濾、用蒸餾水沖洗3次，把藻泥與已稱重量的濾紙取出一起放入已烘干至恒重的稱量瓶中，置于80℃烘箱加熱至恒重，稱重，求得光密度與干重的關系。

2 結果與分析

2.1 螺旋藻的吸光度值與干重的關系

判斷螺旋藻在不同的培養條件下生長的狀況，跟蹤測定其生物量是常用的方法。生物量測定有多種方法，如細胞干重法、光密度（OD）法等，從不同側面反映了相應微藻的生長狀況，前者精確，費時；后者便捷。因此，為了快速、方便的實現兩種指標的互換，按照1.3.3方法操作，動態檢測了螺旋藻培養液的吸光度值與干重的關系[7-8]，見圖1。

圖1 光密度與細胞干重的關系Fig.1 The relationship between the optical density and cell dry weight

由圖1可見，細胞干重與螺旋藻培養液OD560nm之間存在很好的線性關系，回歸可得：Y=10.664X+0.002 4。式中：Y為吸光度值；X為細胞干重值。因此，可以通過測定培養液的OD可以得到不同培養液的藻的生物量，為后續的研究工作提供方便。

2.2 采用廢水培養螺旋藻初探

2.2.1 廢水及AB培養基的一些理化指標

溶液中的鹽度、pH是培養螺旋藻的重要指標。可以直接采用電導儀和pH計測定溶液用電導率和pH。廢水和AB培養基的理化參數見表1。

表1 廢水及AB培養基的一些理化指標Table 1 Some physical and chemical indicators of the wastewater and AB medium

從表1可知，廢水中的鹽的濃度和pH與AB培養基相差較大。

2.2.2 純凈水生產廢水直接培養螺旋藻初步研究

將螺旋藻按照10%（體積分數）的接種量接種于滅菌廢水中，觀察不同時間的培養液的顏色和吸光度值。結果見表2和表3。

由表2和表3可知，直接用廢水培養螺旋藻，螺旋藻不能生長，而且很快死亡，因此用廢水直接培養螺旋藻是不可行的，必須改變廢水的營養成分。

表2 廢水中鈍頂螺旋藻869的生長狀態Table 2 Spirulina platensis 869 growth state cultured in the wastewater

表3 培養液中鈍頂螺旋藻869的生長情況Table 3 Spirulina platensis 869 growth situation in the wastewater

2.3 螺旋藻在單因素改良廢水中的生長狀態研究

2.3.1 添加VB1、VB12對螺旋藻生長的影響

VB1、VB12等有機物有促進生物生長繁殖的作用。有研究顯示VB1、VB12混合液對海洋原甲藻、赤潮生物的生長有顯著的促進作用不同的藻類對于VB1、VB12有一定的相關性[9-10]。因此本實驗首先探究通過添加VB1、VB12對廢水培養基培養螺旋藻生長情況的。以AB培養基為參考，1 L廢水加入1 mL VB12液，使其終濃度為0.15 μg/L為培養基，結果如表4，表5所示。

表4 廢水中只添加VB12鈍頂螺旋藻869的生長狀態Table 4 Spirulina platensis 869 growth state cultured in the wastewater modified with vitamin B12

表5 添加VB12后培養液中鈍頂螺旋藻869的生長情況Table 5 Spirulina platensis 869 growth situation in the wastewater modified with vitamin B12

通過實驗可知只加入VB12來調節廢水培養基的營養成分，結果并沒有得到改善。由這個實驗可以推測廢水中的無機鹽含量應該是影響鈍頂螺旋藻生長的主要原因。

2.3.2 添加K2HPO4對螺旋藻生長的影響

從廢水的理化參數表1可知，廢水與AB培養基在電導率上有較大的差異。因此，向廢水中加入一些可溶性的無機鹽，提高廢水溶液的電導率來研究螺旋藻生長情況。無機鹽有多種，包括N、P、S、K等。鮑亦璐等研究表明，螺旋藻培養過程中營養源消耗量為：N源（NO3-）、P 源（HPO42-）、S 源（SO42-），而 Cl-基本不消耗[11-12]。由凱氏定氮測定AB培養基和廢水中的總氮含量，顯示廢水中的氮含量要高于AB培養基中的（結果未顯示），因此不用再向廢水中添加氮源。

不添加或只添加VB12，培養螺旋藻都有藻體發黃的現象。有研究表明當磷源不足時會影響螺旋藻葉綠體的含量，出現發黃的癥狀，所以磷源應該是廢水中缺乏的一種營養成分[13]。向廢水中加入不同濃度的K2HPO4，對螺旋藻生長狀態和生物量的影響結果如表6，圖2所示。

表6 廢水中只添加K2HPO4鈍頂螺旋藻869的生長狀態Table 6 Spirulina platensis 869 growth state cultured in the wastewater modified with K2HPO4

圖2 添加K2HPO4后各種培養液中鈍頂螺旋藻869的生長曲線圖Fig.2 Spirulina platensis 869 growth curves cultured in the wastewater modified with K2HPO4

由表6和圖2可以看到，通過加入K2HPO4之后，鈍頂螺旋藻的生長狀況得到了改善。當K2HPO4的濃度小于0.5 g/L時，藻生長量濃度增加不大，藻液呈黃綠色，表現出缺乏磷源。磷源濃度為0.5 g/L時，藻體生長正常，藻呈綠色，藻濃度一直呈現上升趨勢。磷源濃度達到0.6 g/L時，對藻生長并沒有起到有效地促進作用，后期藻濃度略低于前者，從K2HPO4的添加量和藻生長情況綜合考慮，選擇0.5 g/L添加量作為廢水培養基的磷源添加濃度。

但實驗結果顯示，盡管加入了磷源，鈍頂螺旋藻的生長狀況改善，與AB培養基中的螺旋藻相比較，藻體生長還是大幅落后。

2.3.3 添加NaHCO3對螺旋藻生長的影響

由表1顯示，廢水與AB培養基差異比較大的理化指標之一是pH。NaHCO3除了可以調整廢水中的pH作用之外，還可以向螺旋藻提供C源。在螺旋藻的培養溶液中，CO2含量是非常低的，HCO3-則占了絕大部分，外源無機碳主要利用形式是HCO3-。同時NaHCO3可以起到保持培養基較強的堿性和pH緩沖作用，有利于防止其他藻類的污染[14-15]，向已添加0.5 g/L K2HPO4的廢水中分別加入不同濃度的NaHCO3進行對比實驗，選擇出最適合的條件。結果如表7所示，并且由實驗數據繪制加入不同濃度的K2HPO4的各藻液的生長曲線見圖3。

表7 廢水中只添加NaHCO3鈍頂螺旋藻869的生長狀態Table 7 Spirulina platensis 869 growth state cultured in the wastewater modified with NaHCO3

圖3 添加NaHCO3各個培養液中鈍頂螺旋藻869的生長曲線圖Fig.3 Spirulina platensis 869 growth curves cultured in the wastewater modified with NaHCO3

由此實驗的結果可知在加入了NaHCO3之后，藻體的生長情況的得到了較好改善，在培養周期內，藻體沒有出現發黃及死亡的現象。對圖3以及表7進行分析，添加不同濃度的NaHCO3的培養基對照組，藻體生長良好。當NaHCO3濃度小于8.0 g/L時，螺旋藻的生長遲緩，當NaHCO3濃度達到8.0 g/L及以上時，廢水的pH增大至9以上，但是各種添加濃度之間，螺旋藻的生長狀態差異不顯著。隨著培養時間的延長，生物量呈穩步增值趨勢，第7天達到最大值。綜合考慮，選擇8.0 g/L NaHCO3添加量作為廢水培養基的碳源濃度。但是與同時培養的AB培養液相比，螺旋藻的生長狀況還是比較緩慢。

2.4 螺旋藻在綜合改良廢水中的生長狀態研究

雖然廢水經過添加C、P無機鹽后，螺旋藻可以生長，但與AB培養基比較，還是有較大的差距。為了使螺旋藻更好的生長，在已經添加了磷源和碳源的基礎上，再加入VB12，使其終濃度為0.15 μg/L，作為改良廢水（1），另外，在改良廢水（1）的基礎上，再按照 AB 培養基的營養添加組分和濃度，添加As液和PIV液，作為廢水（2），觀察培養螺旋藻的生長情況。

表8 鈍頂螺旋藻869在改良廢水（1）和（2）的生長狀態Table 8 Spirulina platensis 869 growth state cultured in the improved wastewater（1）and（2）

圖4 鈍頂螺旋藻869在改良廢水（1）和（2）的生長曲線Fig.4 Spirulina platensis 869 growth curves cultured in the improved wastewater（1）and（2）

由實驗數據分析，在添加了維生素液以及As液和PIV液之后，兩種廢水培養基與AB培養基中的螺旋藻相比較，它們的生長情況比較一致。在生長的前期，只添加了維生素液的培養基中的螺旋藻生長較快，這可能鈍頂螺旋藻能夠比較快的適應它的營養環境，而對于另外兩種培養基則需要相對長一點的適應期。到了第4天，廢水培養基（2）中的藻體生長很快，AB培養基中的螺旋藻顯然也加快了生長，這兩者的生長情況比較一致，藻液濃度增長的趨勢也很平穩。到了第7天，廢水培養基（2）中的藻濃度達到最大值，吸光度為1.886。這一實驗表明了廢水再經過了一系列的調節后，培養螺旋藻的能力可以得到大幅度的提高。

3 結論

每升純凈水生產廢水中添加0.5 g K2HPO4，8 g NaHCO3、0.15 μg VB12，再按照 AB 培養基配方添加 As液和PIV液，在光強強度4 000 lx、溫度24.8℃，光暗周期為12 h∶12 h的條件下培養螺旋藻7 d，達到生物量1.766 g（DW）/L，與螺旋藻在傳統AB培養基和相同的培養條件下的生物量相當。

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