HPLC測定海南產胡椒中胡椒堿的含量

郭飛燕，王友志，王曉青，姚亮，紀明慧，謝樂瓊

（海南師范大學“省部共建-熱帶藥用植物化學”教育部重點實驗室，海南海口 571158）

胡椒（Piper nigrum）為胡椒科胡椒屬植物[1]，是海南的特產之一，海南白胡椒因其質優、味辣在國際市場享有較高的聲譽。胡椒堿是胡椒中具有許多藥理活性的主要化學物質，目前，已發現胡椒堿具有抗氧化、免疫調節、抗腫瘤、促進藥物代謝等作用[1-3]，胡椒中胡椒堿的含量因品種、產地，栽培環境的不同而存在差異，因此其含量是胡椒品質評定的重要指標。

目前，已報道的胡椒堿的提取方法和含量測定很多[4-7]，但未見用HPLC法測定海南不同地區產胡椒中胡椒堿的文獻報道。本工作擬利用索氏提取法分別對海南不同地區產的胡椒果實及胡椒根和胡椒葉中胡椒堿進行提取，并采用HPLC對胡椒堿的含量進行測定。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

試驗用的成熟胡椒果實產于海南臨高、萬寧、陵水、瓊山、文昌、保亭、東方7個地方。樣品烘干粉碎，密封保存，備用。

胡椒堿對照品：瑞士，Fluka Chemie AG，CH-9470 Buchs，GR，分子量：285.34。甲醇：色譜純，天津市四友精細化學品有限公司；無水乙醇、丙酮、乙酸乙酯、苯等均為分析純。

高效液相色譜儀（ΜV230+、P230）：大連依利特分析儀器有限公司；EC2000工作站：大連依利特分析儀器有限公司；KQ2200E超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；DZG-6050真空干燥箱：上海森信實驗儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 色譜檢測條件

選擇色譜柱為大連依利特、250 mm×4.6 mm，5 μL；KromasiL），檢測波長 343.0 nm，以甲醇－水（77∶23）為流動相，流動速度1.0 mL/min；柱溫為室溫[4-6]。

1.2.2 供試液的制備

1.2.2.1 對照品溶液

精密稱取胡椒堿標準品0.030 0 g，置于100 mL容量瓶中，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，再精密量取5 mL胡椒堿乙醇溶液，置50 mL容量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，待用。

1.2.2.2 供試品溶液

精密稱取胡椒干粉0.100 0 g，置250 mL的平底燒瓶中，加入100 mL 80%乙醇，索氏提取48 h。提取液移入100 mL容量瓶，并加80%乙醇稀釋至刻度，待用。

1.2.3 色譜峰的建立

參照文獻[6]方法分別取對照品溶液和供試品溶液各20 μL，進樣分析，記錄色譜圖。進樣前先用0.45 μm的濾膜過濾。

1.2.4 對海南不同地區產胡椒中胡椒堿的提取

分別精確稱取臨高、萬寧、陵水、瓊山、文昌、保亭、東方7個不同地區產的胡椒果實干粉0.100 0 g，用紗布包裹，于索氏提取器中，加入80%無水乙醇100 mL加熱回流提取，用毛細管取回流液點于玻璃硅膠板上，晾干，置于 V（苯）∶V（乙酸乙酯）∶V（丙酮）=7∶2 ∶1（mL/mL）的展開劑中，取出晾干，在365 nm紫外分析儀下檢測至無紫蘭色斑點[4]，即無胡椒堿檢出為止，提取液移入100 mL容量瓶，并加80%乙醇稀釋至刻度，取20 μL提取液注進高效液相色譜儀進行分析，記錄色譜圖。

1.2.5 對海南萬寧地區胡椒不同部位胡椒堿的提取

分別精確稱取萬寧胡椒的果實、根、葉各0.100 0g，用紗布包裹，置索氏提取器中，加入80%無水乙醇100 mL，加熱回流至胡椒堿提取完全。提取液移入100 mL容量瓶，并加80%乙醇稀釋至刻度，取20 μL提取液注進高相色譜儀進行分析，記錄色譜圖。

2 結果與討論

2.1 方法學考察

2.1.1 空白試驗

取無水乙醇空白溶液20 μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。結果溶劑出峰少，對圖譜及含量檢測基本無干擾。

2.1.2 色譜峰的建立

以甲醇－水（77∶23）為流動相，檢測波長343.0 nm，流動速度1.0 mL/min；柱溫為室溫。參照文獻[4-5]方法分別取對照品溶液和供試品溶液各20 μL，進樣分析，記錄色譜圖，見圖1、圖2。

圖1 胡椒堿標準品的HPLC圖Fig.1 Piperine standard HPLC diagram

圖2 胡椒供試品HPLC圖Fig.2 HPLC of Piperine samples

2.1.3 線性關系

精密稱取胡椒堿標準品0.050 0 g，置50 mL容量瓶中，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，再精密量取5 mL，置50 mL容量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻。分別取 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 mL 于 10 mL容量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻。取上述溶液各20 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。以總峰面積（A）為縱坐標，濃度（C）為橫坐標繪制標準曲線，并計算相關系數及回歸方程。胡椒堿在0.020 mg/mL～0.080 mg/mL的濃度范圍內線性關系良好，Y=306 319.892 86+1.454 55×108x，r=0.999 7。

2.1.4 精密度試驗

準確稱取胡椒堿標準品0.030 0 g，置100 mL容量瓶中，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，再精密量取5 mL，置50 mL容量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻。取20 μL溶液注入液相色譜儀，連續進樣6次，記錄色譜圖。各色譜峰相對保留時間的RSD小于1.00%、相對峰面積值的RSD小于5.00%，表明精密度良好。胡椒堿的含量測定的總峰面積的相對標準偏差為0.41%，符合含量測定要求。

2.1.5 供試品穩定性試驗

分別于 0、2、4、8、24 h 各取 20 μL 供試品溶液進行測定。試驗結果表明：各色譜峰相對保留時間的RSD小于1.50%、相對峰面積值的RSD小于5.00%，表明溶液24 h內穩定。胡椒堿的含量測定的總峰面積的相對標準偏差為1.32%，符合含量測定要求。

2.1.6 重復性試驗

配制同一批供試品溶液6份，各取20 μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。試驗結果表明：各色譜峰相對保留時間的RSD小于1.00%、相對峰面積值的RSD小于5.00%，表明重現性良好。胡椒堿的含量測定的相對標準偏差為0.86%，符合含量測定要求。

2.2 海南胡椒中胡椒堿的提取

2.2.1 胡椒堿的含量測定

取樣品溶液的峰面積、標準品溶液的峰面積等數據代入公式計算。

樣品濃度（%）=（W對×對照品含量×（1-對照品水分）×A樣×樣品稀釋倍數）/（A對×對照品稀釋倍數）

式中：W對為對照品質量，g；A樣為樣品溶液峰面積，A對標準品溶液峰面積。

2.2.2 海南不同地區胡椒中胡椒堿含量測定

分別精確稱取不同地區產成熟胡椒果實干粉0.100 0 g，用紗布包裹，于索氏提取器中，加入80%無水乙醇100 mL，加熱回流提取至胡椒堿提取完全，所得提取液用HPLC進行測定，結果見表1。

表1 不同產地胡椒中胡椒堿的含量測定結果Table 1 The determine results of Piperine from different regions of Piper nigrum L.

從表1可以看出，不同地區產胡椒中胡椒堿含量不同，實驗結果表明，東南地區種植的胡椒中胡椒堿含量要比中西部地區種植的胡椒中胡椒堿含量高，海南萬寧地區產的胡椒中胡椒堿含量高達3.17%。其次為海南陵水產胡椒，其中胡椒堿含量高達2.93%。據文獻報道胡椒只能生長在年降水量2 500 mm的熱帶地區，生長期中還需要一段干熱的間隔期[8]。土壤、氣溫、濕度等因素會影響胡椒的生長和其中總生堿的含量，海南東南部地區較適合胡椒的種植。

2.2.3 海南胡椒不同部位胡椒堿的提取

分別精確稱取萬寧胡椒的果實、根、葉各0.100 0 g，用紗布包裹，置索氏提取器中，加入80%無水乙醇100mL，加熱回流至胡椒堿提取完全。提取液移入100 mL容量瓶，并加80%乙醇稀釋至刻度，取20 μL提取液注進高相色譜儀進行分析，記錄色譜圖，結果見表2。

表2 胡椒不同部位胡椒堿的含量Table 2 Piperine content in different parts of the Piper nigrum L.

從表2可知，在萬寧產的胡椒中，果實、根、葉中胡椒堿的含量分別為3.17%、0.43%、0.01%，根部的胡椒堿的含量比葉中的高，而果實中的胡椒堿含量比根和葉中要高得多。

3 結論

以80%乙醇為溶劑，采用索氏提取法分別從海南不同地區產的胡椒果實及胡椒根和胡椒葉中提取胡椒堿，并以HPLC法測定提取液中胡椒堿含量。結果表明，萬寧、陵水地區產的胡椒中胡椒堿含量比較高，分別可達3.17%和2.93%；海南萬寧地區種植的胡椒中根部和葉中胡椒堿的含量都很低。產地，栽培環境對胡椒的生長會有一定的影響，會造成其中生物堿的含量的差異。

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[1]韋琨,竇德強,裴玉萍,等.胡椒的化學成分、藥理作用及與卡瓦胡椒的對比[J].中國中藥雜志,2002,27(5):328-333

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[3]劉屏,索婧俠,于騰飛.胡椒堿藥理作用的研究進展[J].中國藥物應用與監測,2007(3):7-9

[4]陶元器,鄧躍.從黑胡椒中提取胡椒堿[J].云南化工,1991(1/2):92-93

[5]陳寒杰.HPLC測定二十五味鬼臼丸中胡椒堿的含量[J].中成藥,2007,29(2):296-297

[6]劉文,孫宇章.胡椒中胡椒堿的提取工藝研究[J].中國中藥雜志,2003,28(5):456-457

[7]張華蕓,宿松光,林玉梅.高效液相色譜法測定胡礬口腔膜中胡椒堿的含量[J].中國醫院藥學雜志,2006,26(5):630-631

[8]楊自朋.胡椒中總生物堿提取工藝的研究[J].齊魯藥事,2006,25(11):685-686