紫外分光光度法測定薯蕷皂甙元含量的研究

沈暉，趙叢叢，劉曾，曾凡駿

（四川大學輕紡與食品學院，四川成都 610065）

薯蕷皂甙元又稱皂素，可溶于石油醚等有機溶劑，自上世紀30年代日本生化學家從薯蕷屬的山箄中分離出第一個薯蕷皂甙元，開創了利用植物原料進行甾體藥物合成的先河以來[1]，已有約400多種藥物以薯蕷皂甙元為原料或中間產物，通過衍生、合成而制得。我國作為薯蕷皂甙元主要生產國，年產量占世界總產量的60%，其中2/3直接用于出口[2]。目前薯蕷皂甙元的檢測方法有氣相色譜、高效液相色譜法等，而一般薯蕷皂甙元生產企業條件設備有限，因此一種簡單、有效、快速的薯蕷皂甙元含量的測定方法在實踐應用中具有重要價值。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

752紫外光柵分光光度儀：上海精密科學儀器有限公司；TG628A分析天平；DSY-1-4孔電熱恒溫水浴鍋：北京愛琦霞商貿有限公司；燒杯、比色管、移液管、比色皿、洗瓶、膠頭滴管若干等。

1.2 試劑

薯蕷皂素標準品：成都普思生物科技有限公司；乙醇、高氯酸、冰乙酸均為分析純；蒸餾水。

5%香草醛-冰醋酸溶液：稱取5 g香草醛，加冰乙酸溶解并定容至100 mL。

薯蕷皂甙元標準溶液：20 mg薯蕷皂甙元標準品溶于石油醚中，定容于50 mL容量瓶中。

薯蕷皂甙元樣品溶液：準確稱取菊葉薯蕷干粉20 g，加入80 mL濃度為3 mol/L的硫酸溶液酸解4 h，之后過濾，用水洗至中性，濾渣烘干，用400 mL石油醚抽提8 h，回收溶劑，待燒瓶中提取液體積50 mL左右停止加熱，提取液冷卻后倒入150 mL容量瓶中，石油醚定容，移液管移取10 mL至100 mL容量瓶中，用石油醚定容至100 mL。

2 檢測方法

2.1 檢測條件的確定

2.1.1 吸收光譜的確定

取皂甙元標準溶液0.1 mL，樣品溶液0.1 mL于10 mL比色管中，揮干，再分別加5%香草醛－冰醋酸溶液0.2 mL和高氯酸0.8 mL混勻、密塞，置70℃恒溫水浴中顯色15 min，取出后立即以冰水冷卻5 min，加入冰醋酸定容至10 mL，搖勻，靜置20 min，以試劑空白為參比，用分光光度計于波長400 nm～700 nm處掃描，確定最大吸收波長。

2.1.2 5%香草醛－冰醋酸溶液的加量

取標準皂甙元溶液0.1 mL于10 mL比色管中，揮干溶劑，分別加5%香草醛－冰醋酸溶液0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 mL和高氯酸0.8 mL混勻、密塞，置70℃恒溫水浴中顯色15 min，取出后立即以冰水冷卻5 min，加入冰醋酸定容至10 mL，搖勻，靜置20 min，以試劑空白為參比，用紫外分光光度計于薯蕷皂甙元最大吸收波長處測定吸光度。

2.1.3 高氯酸溶液的加量

分別加高氯酸 0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL 和 0.2 mL 5%香草醛－冰醋酸溶液混勻，按2.1.2進行實驗。

2.1.4 水浴溫度

按 2.1.2 實驗，分別置于 50、60、70、80、90 ℃恒溫水浴中顯色15 min。

2.1.5 水浴時間

按2.1.2實驗，分別置于80℃恒溫水浴中顯色5、10、15、20 、25 min。

2.1.6 放置時間

按2.1.2實驗，搖勻后分別靜置 10、20、30、40、60min。

2.2 檢測方法評價

2.2.1 薯蕷皂甙元標準曲線的繪制

分別吸取 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL 標準溶液于具塞比色管中，以上述實驗所得的最優檢測條件按2.1.2進行實驗，繪制薯蕷皂甙元標準曲線。

2.2.2 精密度實驗

取1 mL薯蕷皂甙元樣品溶液以實驗確定的最佳檢測條件按2.1.2中操作進行檢測，重復測定吸光度，計算相對標準偏差（RSD）。

2.2.3 加標回收率實驗

取已知濃度的薯蕷皂甙元樣品溶液5份（每份體積皆為0.1mL，同時取0.1mL樣液經測定當中薯蕷皂甙元濃度為0.206 mg/mL），分別加入非等量的薯蕷皂甙元標準溶液（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL），以實驗確定的最佳檢測條件按2.1.2進行實驗操作并計算加標回收率。

3 結果與分析

3.1 檢測條件的確定

3.1.1 吸收光譜的確定

薯蕷皂素檢測波長掃描圖，見圖1。

圖1 薯蕷皂素檢測波長掃描圖Fig.1 Wavelength scan of diosgenin

由圖1可知薯蕷皂甙元的最大吸光度在452 nm處，因此選擇452 nm作為薯蕷皂甙元的檢測波長。

3.1.2 5%香草醛－冰醋酸溶液加量對吸光度的影響

5%香草醛－冰醋酸溶液加量對吸光度的影響，見圖2。

圖2 5%香草醛-冰醋酸溶液加量對吸光度的影響Fig.2 Effect of 5%vanillin-glacial acetic acid solution dosage on absorbance

由圖2可以看出，隨著香草醛－冰醋酸加量的增大，吸光度增大，當其加量到0.2 mL后，吸光度趨于穩定，確定5%香草醛－冰醋酸的加量為0.2 mL。

3.1.3 高氯酸溶液加量對吸光度的影響

高氯酸溶液加量對吸光度的影響見圖3。

圖3 高氯酸加量對吸光度的影響Fig.3 Effect of high acid solution dosage temperature

圖3表明隨著高氯酸溶液的加量的增加吸光度先增大后減小，當用量在0.7 mL時，吸光度達到最大，因此確定高氯酸的加量為0.7 mL。

3.1.4 水浴溫度對吸光度的影響

水浴溫度對吸光度的影響見圖4。

圖4 水浴溫度對吸光度的影響Fig.4 Effect of water bath temperature

由圖4知水浴溫度在70℃以下時，吸光度較為穩定，溫度在80℃時，吸光度達到最大，之后隨著溫度的增加吸光度急劇下降，故確定反應溫度為80℃。

3.1.5 水浴時間對吸光度的影響

水浴時間對吸光度的影響見圖5。

圖5 水浴時間對吸光度的影響Fig.5 Effect of water bath time on absorbance

由圖5可知一定的反應時間內，反應充分，吸光度也較為穩定，隨著反應時間的延長，副反應的發生會影響顯色效果，導致吸光度下降。所以確定反應時間為15 min。

3.1.6 放置時間對吸光度的影響

放置時間對吸光度的影響，見圖6。

由圖6看出，當放置時間大于20 min時，吸光度趨于穩定。因此確定放置時間為20 min。

圖6 放置時間對吸光度的影響Fig.6 Effect of storage time on absorbance

3.2 實驗方法評價

3.2.1 薯蕷皂甙元標準曲線的繪制

薯蕷皂甙元標準曲線如圖7所示，結果表明薯蕷皂甙元在0.04 mg～0.24 mg范圍內，吸收度呈良好線性關系，其回歸方程為y=4.237 1x+0.007 1，r=0.999 2。

圖7 薯蕷皂甙元標準曲線Fig.7 Concentration-absorbency curve of diosgenin

3.2.2 精密度實驗

精密度實驗結果如表1所示。

表1 精密度實驗結果Table 1 Results of precision experiment

由表1中的實驗結果表明，相對標準偏差為1.123%，方法重現性好。

3.2.3 加標回收率實驗

加標回收率結果如表2所示。

表2 薯蕷皂甙元加標回收率的計算Table 2 Results of average recovery

由表2中的計算結果表明用此檢測方法檢測薯蕷皂甙元具有較高的加標回收率。

4 結論

本文對薯蕷皂甙元的檢測條件進行了系統分析，得到最佳優化條件為，檢測波長：452 nm，5%香草醛-冰醋酸溶液的加量：0.2 mL，高氯酸溶液的加量：0.7 mL，水浴溫度：80 ℃，水浴時間：15 min，放置時間：20 min，精密度實驗的相對標準偏差（RSD）與加標回收率實驗的平均回收率分別為1.123%與99.5%，通過以上分析表明該法具有良好的穩定性、靈敏性與再現性，同時用紫外分光光度計測定薯蕷皂甙元含量操作簡單、設備要求低，能夠滿足一般生產企業的需求。

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[1]陳新榮,楊天龍,胡世波.菊葉薯蕷產業化發展優勢及綜合利用前景分析[J].攀枝花科技與信息,2007,11(4):6-8

[2]李輝,倪晉仁.薯蕷皂甙元的研究進展[J].精細化工,2010,27(1):60-65

[3]王俊,楊克迪,陳鈞.分光光度法測定薯蕷皂苷元[J].分析實驗室,2004,23(1):73-75

[4]Slack S C,MaderW J.Colorimetric assay for diosgenin and related compounds[J].Analytical chemistry,1961,33(4):625

[5]喬春峰,檀愛民,董輝,等.國產閉鞘姜屬植物中薯蕷皂甙元的含量測定[J].中國藥科大學學報,2000,31(2):156-158