兩種熒光定量聚合酶鏈反應法檢測乳腺癌組織中微小RNA－21的應用分析

張晟春，王 燕，張興毅，王才友

目前微小RNA(microRNA，miR)在疾病中起的重要作用越來越來受到人們的重視，有報道顯示乳腺癌和miR－21相關［1］，miR－21在乳腺癌中可能具有疾病診斷與預后判定的潛在價值，還可能是有效的治療靶點，miR－21在乳腺癌中表達增高并與腫瘤的浸潤與轉移相關。熒光定量聚合酶鏈反應(FQ－PCR)技術作為檢測基因表達的最簡便和易行的手段，在科研和臨床上都已得到普遍的應用。通常使用的標記物有SYBR GreenⅠ染料和TaqMan探針，本研究建立兩種檢測模式，檢測miR－21在乳腺癌組織與癌旁組織中的表達，并進行比較，選擇臨床更適用的檢測方法。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2010年度遵義醫學院附屬醫院普外科住院的手術治療的乳腺癌患者14例，均為女性;平均年齡47.3歲。均經病理證實為乳腺癌，其中浸潤性導管癌11例，乳腺小管癌1例，原位癌1例，黏液癌1例。手術切除的乳腺組織標本，包括乳腺癌組織和癌旁組織 (距腫瘤邊緣＞5 cm)14對。實驗室編號為1～28號，其中單號為癌旁組織，雙號為與單號配對的乳腺癌組織。術中標本移出體外后立即切取1 cm×1 cm迅速置于液氮中冷凍，－80℃保存備用，其余送病理科做病理檢查。

1.2 主要試劑 TRIzol試劑，cDNA合成試劑盒，無RNA酶的糖原購于invitrogen公司;U6寡核苷酸探針，TaqMan探針法PCR試劑，Taq酶及配套試劑購于上海生物工程有限公司;SYBR GreenⅠ染料法定量PCR試劑購于ABI公司;其他未列出的各種化學試劑均為Sigma公司產品或國產分析純。

1.3 方法

1.3.1 乳腺癌組織和癌旁組織RNA提取 從－80℃低溫冰箱取出標本后迅速移至冰上，切取50～100 mg組織，置1.5 ml離心管中，加入1 ml Trizol然后使用電動勻漿機以3 500 r/min(離心半徑3 cm)的速度對組織進行快速勻漿，40 s，室溫靜置5 min。加入0.2 ml氯仿，劇烈振蕩15 s，靜置3 min。4℃離心，12 000 r/min×10 min(離心半徑8 cm)，取上清。加入0.5 ml異丙醇，－20℃沉淀20 min。4℃離心，12 000 r/min×10 min(離心半徑8 cm)，棄上清。加入1 ml 75%乙醇輕輕洗滌RNA沉淀斑塊后加入適量的Rnase－free H2O溶解。

1.3.2 提取總RNA純度鑒定 采用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，觀察總RNA的5 S rRNA、18 S rRNA和28 S rRNA條帶情況，RNA條帶完整，5 S rRNA的條帶較弱，28 S rRNA的亮度約為18 S rRNA的 2倍，OD260/OD280比值1.8～2.0，說明RNA純度較高，可為后續實驗所用。

1.3.3 cDNA第一鏈合成 在0.2 ml PCR管中加入以下試劑:Total RNA，5.0 μl; 特異性引物+U6R引物，1.0 μl;Rnasefree ddH2O，5.0 μl;70℃溫浴5 min。冰浴10 s，離心加入下列試劑:5 ×Reaction Buffer，4.0 μl;dNTP Mix(10 mmol/L)，2.0 μl;Rnase inhibitor(20 U/μl)，1.0 μl;AMV Reverse Transcriptase(10 U/μl)，2.0 μl。Total volume，20.0 μl。37℃溫浴5 min。42℃溫浴60 min。70℃溫浴10 min，終止反應。將上述溶液－20℃保存，備用。

1.3.4 引物、探針序列的設計與合成 根據miR－21和U6基因相應的全基因序列，應用PrimerPremie:5.0軟件進行引物、探針設計。內參基因 U6，F Primer:5'－CTGCTTCGGCAGCACA－3';R Primer:5'－AACGCTTCACGAATTTGCGT－3';Probe:CCATGCTAATCTTCTCTGTATCGTTCCA目的基因miR－21，特異性反轉錄引物miR－21 RT:5'－CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCAACATCAG－3';F Primer:5'－ACACTCCAGCTGGGTAGCTTATCAGACTG－3';R Primer:5'－TGGTGTCGTGGAGTCG－3';Probe:CAATTCAGTTGAGTCAACATCAGTC。

1.4 Real－Time PCR反應

1.4.1 SYBR GreenⅠ染料法 總反應體積為 20 μl，2×SYBR Green PCR Master Mix，10 μl;F Primer(10 μmol/L)，1 μl;R Primer(10 μmol/L)，1 μl;ddH2O，7 μl;Template(cDNA)，1 μl。冰浴中充分混勻擴增反應條件:95℃ 10 min變性，95℃ 15 s，60℃ 1 min，40個循環。擴增完后，進行熔解曲線分析60℃2 min，以0.1℃/s的速率升溫，直到95℃;整個過程進行連續采集熒光，獲得其擴增曲線和熔解曲線并分析后的CT值。

1.4.2 TaqMan探針法 總反應體積為 25 μl，2×HS PCR Master Mix，12.5 μl;F Primer(10 μmol/L)，0.5 μl;R Primer(10 μmol/L)，0.5 μl;Probe(10 μmol/L)，0.5 μl;ddH2O，9 μl;Template(cDNA)，2 μl。冰浴中充分混勻。擴增反應條件:95℃ 2 min變性，95℃ 10 s，60℃ 60 s，40個循環。

1.5 Northern Blot試驗

1.5.1 變性PAGE電泳 1×TBE，25 W預跑 (1 h)。15 μl樣品立即冰浴5 min，加入加樣孔。在5 W電壓下，電泳30 min，再用10 W電壓電泳約80 min。

1.5.2 轉膜、交聯 0.5×TBE中，充分濕潤尼龍膜及厚濾紙2張。平鋪在半干轉膜儀上，蓋上轉印槽，加入穩定電流0.8 mA/cm2，60 min;轉膜后用2×SSC沖洗膜2次。將膜放在紫外線交聯儀中 (85 000 μJ/cm2)，并用兩層干凈濾紙把膜包在中間，然后再用干膠儀抽真空干烤 (80℃)2 h。

1.5.3 預雜交、標記及雜交 尼龍膜用2×SSC的潤濕，后把膜放入雜交瓶，預熱預雜交/雜交液37℃，10 min以上，準備鮭精DNA，95～100℃，5 min，然后冰上15 min。每ml預雜交/雜交液加入10 μl(100 μg) 鮭精DNA。在雜交管中加入事先預熱的預雜交/雜交液及鮭精，放于雜交爐中，37℃以最慢轉速轉2 h～ON(over night)。

1.5.4 探針制備 探針制備參見引物序列的設計與合成部分，反應體系為20 μl混合物，反應條件:37℃孵育1 h，70℃滅活15 min;把探針加入到變性的鮭精DNA中，混合均勻后放入雜交爐，37℃，24 h～ON。

1.5.5 洗膜、放射自顯影及探針的去除/洗脫 加入2×SSC，洗去殘留同位素。用鑷子取出膜，用保鮮膜包膜磷屏中曝光。用嚴謹洗脫液 (0.1%SDS，0.1×SSC)洗1～3次。方法:雜交爐內85～90℃，旋轉40 min。

1.6 統計學方法 使用MX－3000P軟件收集整個PCR過程中的熒光，采用相對定量法，分析乳腺癌細胞內miR－21基因相對于U6內參基因的表達變化，所有樣本的檢測均平行重復3次，PCR擴增后，采集對應的CT值，得到乳腺癌組織和癌旁組織的Mean CT值和△CT值。應用SPSS 15.0統計軟件進行統計學分析，計量資料以 (±s)表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RNA抽提質量鑒定結果 提取的Total RNA經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。凝膠電泳圖從左到右依次為1～28號樣本 (見圖1)。

圖1 Total RNA 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性Figure 1 AGE of total RNA

2.2 PCR擴增結果

2.2.1 擴增曲線結果 擴增曲線顯示SYBR GreenⅠ染料法和TaqMan探針法擴增的U6及miR－21的擴增曲線符合PCR擴增規律，表明其結果可靠 (見圖2～5)。

圖2 SYBR GreenⅠ染料法的U6擴增曲線Figure 2 U6 amplification curve of SYBR GreenⅠdye method

2.2.2 熔解曲線結果 U6熔解溫度為82.1℃ (見圖6)，MiR－21熔解溫度為80.6℃ (見圖7)。

2.3 乳腺癌組織與癌旁組織miR－21表達結果 SYBR GreenⅠ染料法檢測乳腺癌組織與癌旁組織中miR－21的表達，差異有統計學意義 (t=6.704，P=0.000，見表1);TaqMan探針法檢測乳腺癌組織與癌旁組織中miR－21的表達，差異有統計學意義 (t=7.238，P=0.000，見表2)。SYBR GreenⅠ染料法與TaqMan探針法檢測乳腺癌組織中miR－21表達，差異無統計學意義 (t=2.33，P=0.053);SYBR GreenⅠ染料法與TaqMan探針法檢測乳腺癌旁組中miR－21表達，差異無統計學意義 (t=0.07，P=0.95)。

圖3 TaqMan探針法的U6擴增曲線Figure 3 U6 amplification curve of TaqMan probe method

圖4 SYBR GreenⅠ染料法的miR－21擴增曲線Figure 4 miR－21 amplification curve of SYBR GreenⅠdye method

表1 SYBR GreenⅠ染料法檢測U6及miR－21表達的比較 (±s)Table 1 Comparison of expression of U6 and miR－21 detected by SYBR GreenⅠdye method

表1 SYBR GreenⅠ染料法檢測U6及miR－21表達的比較 (±s)Table 1 Comparison of expression of U6 and miR－21 detected by SYBR GreenⅠdye method

注:△CT值為miR－21 Mean CT減去U6 Mean CT

癌旁組織實驗編號 U6 Mean CT miR－21Mean CT △CT 1 10.56±0.12 22.01±0.14 11.45 2 15.21±0.06 22 CT乳腺癌組織實驗編號 U6 Mean CT miR－21Mean CT △7.05±0.11 4.36.00±0.11 6.79 3 10.52±0.36 20.56±0.17 10.04 4 24.12±0.15 25.61±0.13 1.49 5 11.32±0.21 19.54±0.24 8.22 6 10.37±0.38 15.32±0.21 4.95 7 13.43±0.10 21.82±0.11 8.39 8 14.21±0.16 18.87±0.10 4.66 9 11.23±0.20 20.54±0.16 9.31 10 10.01±0.11 15.60±0.20 5.59 11 12.31±0.08 19.20±0.11 6.89 12 10.79±0.07 14.75±0.10 3.96 13 13.66±0.14 21.93±0.19 8.27 14 14.54±0.14 22.65±0.13 8.11 15 17.38±0.10 25.47±0.31 8.09 16 23.89±0.15 24.01±0.21 0.12 17 14.56±0.10 22.96±0.20 8.40 18 10.22±0.06 15.29±0.17 5.07 19 13.46±0.16 20.34±0.10 6.88 20 12.64±0.17 17.49±0.04 4.85 21 15.03±0.06 24.27±0.06 9.24 22 14.26±0.17 16.53±0.07 2.27 23 17.40±0.10 25.56±0.34 8.16 24 11.27±0.22 17.39±0.09 6.12 25 14.93±0.08 23.78±0.14 8.85 26 15.32±0.09 18.47±0.10 3.15 27 13.29±0.11 21.88±0.10 8.59 28 12.69±0.06 1

表2 TaqMan探針法檢測U6及miR－21表達的比較 (±s)Table 2 Comparison of expression of U6 and miR－21 detected by TaqMan probe method

表2 TaqMan探針法檢測U6及miR－21表達的比較 (±s)Table 2 Comparison of expression of U6 and miR－21 detected by TaqMan probe method

注:△CT值為miR－21 Mean CT值減去U6 Mean CT

癌旁組織實驗編號 U6 Mean CT miR－21Mean CT △CT 1 10.24±0.17 21.87±0.05 11.63 2 14.84±0.18 22 CT乳腺癌組織實驗編號 U6 Mean CT miR－21Mean CT △7.34±0.15 4.80.41±0.01 7.57 3 9.95±0.02 19.77±0.12 9.82 4 20.27±0.11 23.77±0.13 3.50 5 11.09±0.09 19.11±0.08 8.02 6 10.01±0.15 15.17±0.03 5.16 7 12.51±0.10 22.13±0.03 9.62 8 13.94±0.12 18.43±0.09 4.49 9 11.54±0.13 20.96±0.07 9.42 10 9.75±0.24 15.46±0.06 5.71 11 13.12±0.21 20.22±0.13 7.10 12 10.12±0.27 14.31±0.17 4.19 13 12.91±0.16 21.42±0.05 8.51 14 15.21±0.12 23.01±0.16 7.80 15 17.07±0.10 24.88±0.11 7.81 16 24.80±0.14 24.86±0.27 0.06 17 14.00±0.09 23.00±0.14 9.00 18 9.30±0.13 14.81±0.09 5.51 19 12.68±0.19 20.23±0.02 7.55 20 11.35±0.16 17.15±0.02 5.80 21 14.60±0.08 22.42±0.16 7.82 22 14.02±0.03 16.16±0.02 2.14 23 16.91±0.11 24.61±0.47 7.70 24 10.92±0.22 17.33±0.10 6.41 25 14.56±0.46 23.18±0.09 8.62 26 14.12±0.10 17.65±0.11 3.53 27 12.28±0.07 20.59±0.17 8.31 28 12.54±0.05 1

圖5 TaqMan探針法的miR－21擴增曲線Figure 5 miR－21 amplification curve of TaqMan probe method

2.4 Northern Blot檢測miR－21在乳腺癌組織及癌旁組織中的表達情況 Northern Blot檢測乳腺癌組織和癌旁組織中miR－21的表達，探針分別為miR－21和U6的反義鏈，由32P標記。用Image Quant軟件測定灰度值評定信號表達強弱，結果表明，乳腺癌組織中miR－21高表達，而癌旁組織中miR－21低表達 (見圖8、9)。

3 討論

因miR在不同物種和組織中表達水平上有很大的差異，能準確、靈敏地檢測出miR在相應組織器官中的含量就變得非常重要，并且miR是一類很小的同源分子，部分小RNA的表達水平可能很低，因此需要極為靈敏而定量的檢測方法。基于miR在各方面的重要作用，迫切需要一種簡單、快捷，低成本的檢測方法用于臨床檢驗。

圖6 U6的熔解曲線Figure 6 U6 melting curve

圖7 miR－21熔解曲線Figure 7 miR－21 melting curve

圖8 Northern Blot顯示miR－21在乳腺癌及癌旁組織中的表達情況Figure 8 Expression of miR－21 in breast cancer and surrounding tissues showed by Northern Blot

圖9 Northern Blot顯示miR－21在乳腺癌及癌旁組織中的表達情況的相對灰度值Figure 9 Relative gray value of miR－21 in breast cancer and surrounding tissues showed by Northern Blot

目前已經發展了多種有效的miR－21檢測方法:(1)克隆測序:用于發現新的miR－21的首選方法。(2)芯片技術:可以實現快速、高通量的檢測。但是基因芯片檢測方法的信息質量的穩定性和可重復性比較差，對獲得的結果通常需要采用Northern Blot和實時FQ－PCR方法進行驗證。 (3)Northern Blot:是驗證和確認miR的重要方法，但該方法繁瑣靈敏度較低并且時間較長，不適合用于高通量檢測。 (4)實時FQ－PCR可以精確地定量分析miR的表達，常用的有莖一環的RT－PCR方法 (stem－loop RT－PCR)和poly A加尾的RT－PCR方法［2］。實時FQ－PCR方法具有檢測范圍寬、靈敏性高、精確度高、產出率高、可以進行多重檢測的優點。從原理上講有2大類熒光模式:第1種為熒光雜交探針，如Taq-Man等。第2種為 DNA結合染料，如 SYBR GreenⅠ等。SYBR GreenⅠ實時FQ－PCR法，引物設計較簡單且只需合成序列特異引物，成本相對較低，使用方便等優點而被廣泛應用［3－5］，但是相對而言特異性較差，易受引物二聚體的影響。通過優化反應體系和熒光捕獲點，運用熔解曲線和凝膠電泳可證實其特異性，SYBR GreenⅠ實時FQ－PCR檢測方法可成為一種高敏感性和特異性的方法［6］。

Northern Blot及其衍生方法對miR的定量而言，有一定的優勢，并且也是國際上公認的檢測miR的“金標準”［7］，現已被廣泛應用于miR的表達分析。但用這類方法檢測需要的RNA樣本量非常大，技術復雜，費時、費力，并且對RNase污染非常敏感，任何一步操作不當都會影響其準確性。因此對檢測人員專業程度要求非常高，所以就不可避免地限制了其應用，使其很難引入臨床檢驗。

本研究在檢測miR－21上應用了通用型熒光染料SYBR GreenⅠ染料法和TaqMan探針法，同時檢測14對乳腺癌組織和癌旁組織。用t檢驗比較SYBR GreenⅠ染料法檢測乳腺癌組織和癌旁組織中miR－21的表達結果間有顯著性差異，比較TaqMan探針法檢測乳腺癌組織及癌旁組織中miR－21的表達結果間有顯著性差異，比較SYBR GreenⅠ染料法和TaqMan探針法檢測乳腺癌組織和癌旁組織中miR－21的表達結果間無顯著性差異，并同時應用Northern Blot法進行驗證，檢測乳腺癌組織及癌旁組織中miR－21的表達，結果與染料法和探針法相符，證明染料法與探針法檢測結果可靠。SYBR GreenⅠ染料法熔解曲線單一特異性好，無非特異性產物和引物二聚體。在優化好實驗反應條件提高熒光染料檢測的特異性，避免非特異性熒光檢測的前提下，SYBR GreenⅠ染料法替代Taq-Man探針法進行多個基因定量表達的檢測是完全可行的。SYBR GreenⅠ染料法精確度高，成本相對較低，是更加適用于臨床應用的檢驗方法。

此研究后續還可進行血、乳腺癌組織中的miR－21與乳腺癌的分型、分期、進展和預后的相關性研究，以此為乳腺癌的診治提供更多、更可靠的依據。

1 Hossain A，Kuo MT，Saunders GF.Mir－17－5p regulates breast cancer cell proliferation by inhibiting translation of AIB1 mRNA ［J］.Mol Cell Biol，2006，26(21):8191 －8201.

2 Laterza OF，Lim L，Garrea－Engele PW，et al.Plasma MicroRNAs as sensitive and specific biomarkers of tissue injury［J］.Clin Chem，2009，55(11):1977－1983.

3 馮志新，姜平.豬細胞因子SYBR Green實時PCR檢測方法的建立［J］.現代生物醫學進展，2007，7(1):108－111.

4 岳華.新城疫病毒的熒光定量RT－PCR檢測及RNA干擾［D］.重慶:西南農業大學，2006.

5 童桂香，謝芝勛，黃琦，等.禽呼腸孤病毒實時熒光定量RTPCR檢測方法的建立 ［J］.中國獸醫科學，2007，37(9):767－771.

6 羅嬋，王志強，公方強，等.SYBR Green實時熒光定量PCR檢測水牛體細胞組蛋白乙酰化相關基因mRNA表達［J］.中國獸醫學報，2009，29(2):233－237.

7 Calin GA，Sevignani C，Dumitru CD，et al.Human microRNA genes are frequently located at fragile sites and genomic regions involved in cancers［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2004，101(11):2999 －3004.