阿魏酸鈉對(duì)脂多糖引起的大鼠海馬炎癥反應(yīng)的抑制作用及其機(jī)制探討

閆恩志， 范 瑩， 隋海娟， 劉婉珠， 劉 卓， 金 英*

(1.遼寧醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，遼寧錦州 121001;2.遼寧醫(yī)學(xué)院機(jī)能實(shí)驗(yàn)中心，遼寧錦州 121001)

老年斑和神經(jīng)纖維纏結(jié)是阿爾茨海默病的主要病理改變［1］，膠質(zhì)細(xì)胞激活及細(xì)胞因子的釋放能促進(jìn)老年斑及神經(jīng)纖維的纏結(jié)，研究發(fā)現(xiàn)這一炎癥反應(yīng)過程與阿爾茨海默病患者病情進(jìn)展相關(guān)［2-3］，絲裂原活化蛋白激酶P38(p38MAPK)信號(hào)通路是重要的哺乳動(dòng)物細(xì)胞應(yīng)激信號(hào)傳導(dǎo)通路之一，有研究表明p38MAPK信號(hào)通路的激活能促使單核、巨噬細(xì)胞白介素-1β(IL-1β)的產(chǎn)生，進(jìn)而損傷神經(jīng)元［4-5］，在阿爾茨海默病病人腦內(nèi)也發(fā)現(xiàn)磷酸化p38MAPK表達(dá)明顯增加［6］，放大腦內(nèi)的炎癥反應(yīng)［7］。阿魏酸鈉具有抗氧化、抗自由基及抗炎等藥理作用，研究發(fā)現(xiàn)阿魏酸鈉能保護(hù)老年大鼠海馬神經(jīng)元損傷，改善大鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙［8］，本研究通過大鼠腦室內(nèi)注射脂多糖建立炎癥反應(yīng)模型，研究阿魏酸鈉對(duì)神經(jīng)元保護(hù)作用是否與抑制p38MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 Sprague-Dawley大鼠，體質(zhì)量250 g，雄性，動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(遼)2003-0007，由遼寧醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 藥品和試劑 阿魏酸鈉 (蘇州暢通有限公司，純度大于99%)，脂多糖購于北京邦定泰克生物技術(shù)公司 (純度95%)。磷酸化絲裂原活化蛋白激酶 3/6抗體 (MKK3/MKK6) (Ser189/207，#9231)， 磷 酸 化 p38MAPK (Thr180/Tyr182，#9211)，磷酸化活化轉(zhuǎn)錄因子-2(ATF-2)(Thr71，#9221)，均為兔抗人多克隆抗體，購于Cell Signaling公司 (Beverly，MA，USA)。兔誘導(dǎo)型一氧化氮合酶 (iNOS)、兔白介素-1β(IL-1β)多克隆抗體、堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG購于Santa Cruz公司;TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0購于寶生物工程有限公司 (中國大連);Trizol試劑購于美國Invitrogen公司;β-肌動(dòng)蛋白和NBT/BCIP顯色液購于碧云天試劑公司。

1.3 動(dòng)物分組及模型建立 SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、阿魏酸鈉組 (100、200 mg/kg)。阿魏酸鈉組大鼠灌胃給予不同劑量阿魏酸鈉 (100、200 mg/kg)1.0 mL，對(duì)照組、模型組大鼠灌胃等量生理鹽水。連續(xù)灌胃給藥3周后，大鼠麻醉固定在立體定位儀上，模型組、阿魏酸鈉組無菌條件下將5 μL脂多糖1.0 mmol/L恒速注射到左側(cè)腦室內(nèi)，對(duì)照組注射等量生理鹽水。

1.4 Western blot檢測(cè) 大鼠麻醉，快速取海馬CA1區(qū)，按前述方法進(jìn)行IL-1β、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶 (iNOS)、磷酸化的 MKK3/MKK6、p38MAPK、ATF-2蛋白測(cè)定［9］，簡(jiǎn)言之，SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜，加入一抗4℃過夜，二抗孵育2 h(所有抗體均1∶500稀釋)，避光顯色，掃描圖像，應(yīng)用Window AlphaEase TM FC 32-bit軟件 (Alpha Innotech Corporation，San Leandro，CA，USA)進(jìn)行灰度值分析。

1.5 RT-PCR檢測(cè) 取大鼠海馬CA1區(qū)組織，進(jìn)行IL-1β和iNOS的mRNA表達(dá)測(cè)定，引物序列及實(shí)驗(yàn)過程按前述方法進(jìn)行［10］，擴(kuò)增后產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，掃描圖像，利用Window AlphaEase TM FC 32-bit軟件進(jìn)行灰度值分析。

2 結(jié)果

2.1 阿魏酸鈉對(duì)脂多糖引起的IL-1β表達(dá)增加的抑制作用 Western blot和RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與對(duì)照組相比腦室注射脂多糖能引起IL-1β蛋白和mRNA表達(dá)明顯增加 (P＜0.01)，阿魏酸鈉(100、200 mg/kg)對(duì)IL-1β蛋白及mRNA表達(dá)增加具有明顯的抑制作用 (P＜0.01)(圖1，圖2，表1)。

圖1 阿魏酸鈉對(duì)腦室內(nèi)注射脂多糖所致的大鼠海馬CA1區(qū)IL-1β蛋白表達(dá)的影響Fig.1 Effect of sodium ferulate on the expression of IL-1β protein after intracerebroventricularly being injected LPS in rat hippocampus CA1 regions

圖2 阿魏酸鈉對(duì)腦室內(nèi)注射脂多糖所致的大鼠海馬CA1區(qū)IL-1β mRNA表達(dá)的影響Fig.2 Effect of sodium ferulate on the expression of IL-1β mRNA after intracerebroventricularly being injected LPS in rat hippocampus CA1 regions

2.2 阿魏酸鈉對(duì)脂多糖引起iNOS表達(dá)增加的抑制作用 Westernblot和RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與對(duì)照組相比腦室注射脂多糖能引起iNOS蛋白和mRNA表達(dá)明顯增加 (P＜0.01)，阿魏酸鈉 (100、200 mg/kg)對(duì)iNOS蛋白及mRNA表達(dá)水平增加具有明顯抑制作用 (P＜0.01)(圖3，圖4，表1)。

圖3 阿魏酸鈉對(duì)腦室內(nèi)注射脂多糖所致的大鼠海馬CA1區(qū)iNOS蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effect of sodium ferulate on the expression of iNOS protein after intracerebroventricularly being injected LPS in rat hippocampus CA1 regions

圖4 阿魏酸鈉對(duì)腦室內(nèi)注射脂多糖所致的大鼠海馬CA1區(qū)iNOS mRNA表達(dá)的影響Fig.4 Effect of sodium ferulate on the expression of iNOS mRNA after intracerebroventricularly being injected LPS in rat hippocampus CA1 regions

表1 阿魏酸鈉對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的海馬CA1區(qū)IL-1β、iNOS蛋白和mRNA表達(dá)影響的灰度值分析結(jié)果 (±s，n=3)Tab.1 Effects of sodium ferulate on LPS-induced the expression of IL-1β，iNOS protein and mRNA in rat hippocampus CA1 regions(±s，n=3)

表1 阿魏酸鈉對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的海馬CA1區(qū)IL-1β、iNOS蛋白和mRNA表達(dá)影響的灰度值分析結(jié)果 (±s，n=3)Tab.1 Effects of sodium ferulate on LPS-induced the expression of IL-1β，iNOS protein and mRNA in rat hippocampus CA1 regions(±s，n=3)

注:與對(duì)照組相比，＊＊P＜0.01;與模型組相比，##P＜0.01。

組 別IL-1β蛋白/β-Actin IL-1β mRNA/β-Actin iNOS蛋白/β-Actin iNOS mRNA/β-Actin對(duì)照組 0.237±0.035 0.353±0.023 0.162±0.019 0.423±0.011模型組 0.715±0.072＊＊ 0.867±0.075＊＊ 0.753±0.066＊＊ 1.112±0.077＊＊阿魏酸鈉100 mg/kg組 0.435±0.031## 0.387±0.033## 0.198±0.015## 0.513±0.021##阿魏酸鈉200 mg/kg組 0.419±0.025## 0.315±0.029## 0.176±0.013## 0.465±0.025##

2.3 阿魏酸鈉抑制脂多糖引起的p38MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路相關(guān)蛋白表達(dá)增加 側(cè)腦室注射脂多糖后，大鼠海馬 CA1區(qū)磷酸化 MKK3/MKK6、磷酸化p38MAPK、磷酸化ATF-2蛋白表達(dá)水平較生理鹽水對(duì)照組明顯增加 (P＜0.01)。阿魏酸鈉 (100、200 mg/kg)可明顯對(duì)抗脂多糖引起的磷酸化MKK3/MKK6、磷酸化p38MAPK、磷酸化ATF-2蛋白表達(dá)水平增加 (P＜0.01)(圖5，圖6，圖7，表2)。

3 討論

p38MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路能夠?qū)⒓?xì)胞外刺激與細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄和基因表達(dá)連接起來，是介導(dǎo)阿爾茨海默病病人腦內(nèi)炎癥反應(yīng)的重要通路之一，細(xì)胞外刺激激活 MKK3/MKK6，進(jìn)而激活位于胞質(zhì)內(nèi)的p38MAPK［7，11］，活化的 p38MAPK 可進(jìn)一步激活位于細(xì)胞核內(nèi)的多種轉(zhuǎn)錄因子，啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄活化，合成一些細(xì)胞因子及促凋亡蛋白，從而參與誘導(dǎo)神經(jīng)元的損傷和凋亡［12-13］。本研究結(jié)果顯示大鼠腦室內(nèi)注射脂多糖上調(diào)了磷酸化的 MKK3、MKK6、p38MAPK及ATF2的表達(dá)，說明p38MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路介導(dǎo)了脂多糖誘導(dǎo)的大鼠腦內(nèi)的炎癥反應(yīng)過程。

圖5 阿魏酸鈉對(duì)腦室內(nèi)注射脂多糖所致的大鼠海馬CA1區(qū)磷酸化MKK3/MKK6蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effect of sodium ferulate on the expression of p-MKK3/MKK6 protein after intracerebroventricularly being injected LPS in rat hippocampus CA1 regions

圖6 阿魏酸鈉對(duì)腦室內(nèi)注射脂多糖所致的大鼠海馬CA1區(qū)磷酸化p38MAPK蛋白表達(dá)的影響Fig.6 Effect of sodium ferulate on the expression of p-p38MAPK protein after intracerebroventricularly being injected LPS in rat hippocampus CA1 regions

圖7 阿魏酸鈉對(duì)腦室內(nèi)注射脂多糖所致的大鼠海馬CA1區(qū)ATF-2蛋白表達(dá)的影響Fig.7 Effect of sodium ferulate on the expression ofATF-2 protein after intracerebroventricularly being injected LPS in rat hippocampus CA1 regions

表2 阿魏酸鈉對(duì)脂多糖引起的大鼠海馬CA1區(qū)磷酸化MKK3/MKK6、磷酸化p38MAPK、磷酸化ATF-2蛋白表達(dá)灰度值分析結(jié)果Tab.2 Effects of sodium ferulate on LPS-induced the increase of p-MKK3/MKK6，p-p38MAPK and p-ATF-2 protein level in rat hippocampus CA1 regions(±s，n=3)

表2 阿魏酸鈉對(duì)脂多糖引起的大鼠海馬CA1區(qū)磷酸化MKK3/MKK6、磷酸化p38MAPK、磷酸化ATF-2蛋白表達(dá)灰度值分析結(jié)果Tab.2 Effects of sodium ferulate on LPS-induced the increase of p-MKK3/MKK6，p-p38MAPK and p-ATF-2 protein level in rat hippocampus CA1 regions(±s，n=3)

注:與對(duì)照組相比，＊＊P＜0.01;與模型組相比，##P＜0.01。

組 別 磷酸化MKK3蛋白/β-Actin磷酸化MKK6蛋白/β-Actin磷酸化p38MAPK蛋白/β-Actin磷酸化ATF-2蛋白/β-Actin對(duì)照組 0.155±0.013 0.149±0.012 0.311±0.023 0.156±0.015模型組 0.597±0.015＊＊ 0.537±0.046＊＊ 0.635±0.025＊＊ 0.644±0.029＊＊阿魏酸鈉100 mg/kg組 0.121±0.022## 0.117±0.013## 0.392±0.078## 0.347±0.038##阿魏酸鈉200 mg/kg組 0.129±0.016## 0.125±0.019## 0.173±0.027## 0.371±0.031##

p38MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路具有放大腦內(nèi)炎癥反應(yīng)的作用，研究發(fā)現(xiàn)在老年斑周圍聚集了大量的小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞［2-3］，能夠釋放NO、IL-1β等炎癥因子［15］。釋放的IL-1β等炎癥因子激活位于胞質(zhì)內(nèi)的p38MAPK，活化的p38MAPK迅速移位到細(xì)胞核，激活轉(zhuǎn)錄因子，促使包括IL-1β和TNF-α等與凋亡相關(guān)的炎癥介質(zhì)進(jìn)一步釋放［14-15］，IL-1β的大量釋放又可進(jìn)一步激活p38MAPK通路，加劇炎癥反應(yīng)［16］。NO主要由誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)合成，研究發(fā)現(xiàn)iNOS的產(chǎn)生在IL-1β之后，且具有IL-1β依賴性，IL-1β表達(dá)增加后可通過p38MAPK通路增加星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞iNOS和環(huán)氧化酶表達(dá)，iNOS能夠持續(xù)大量的催化NO產(chǎn)生，在病理情況下，大量合成的NO與氧自由基反應(yīng)后再與蛋白中的酪氨酸殘基作用，產(chǎn)生硝基酪氨酸，硝基酪氨酸可以破壞細(xì)胞膜完整性、抑制線粒體酶活性、損傷DNA結(jié)構(gòu)以及激活凋亡，從而參與阿爾茨海默病疾病進(jìn)程［17］。

本實(shí)驗(yàn)也從基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平上證實(shí)大鼠腦室內(nèi)注射脂多糖能上調(diào)了IL-1β和iNOS表達(dá)，采用大鼠灌胃給予阿魏酸鈉100、200 mg/kg劑量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)阿魏酸鈉在抑制p38MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的同時(shí)，也抑制了IL-1β和iNOS表達(dá)的增加，說明阿魏酸鈉可通過抑制p38MAPK通路發(fā)揮抗炎抗氧化損傷作用，但阿爾茨海默病腦內(nèi)炎癥病變是多重信號(hào)傳導(dǎo)通路共同作用的結(jié)果，阿魏酸鈉是否還存在其他作用還需進(jìn)一步的研究。

［1］Braak H，Braak E.Frequency of stages of Alzheimer-related lesions in different age categories［J］.Neurobiol Aging，1997，18(4):351-355.

［2］Li Y，Liu L，Barger S W，et al.Interleukin-1 mediates pathological effects of microglia on tau phosphorylation and on synaptophysin synthesis in cortical neurons through a p38-MAPK pathway［J］.J Neurosci，2003，23(5):1605-1611.

［3］Guo J T，Yu J，Grass D，et al.Inflammation-dependent cerebral deposition of serum amyloid a protein in a mouse model of amyloidosis［J］.J Neurosci，2002，22(14):5900-5909.

［4］Han J，Jiang Y，Li Z，et al.Activation of the transcription factor MEF2C by the MAP kinase p38 in inflammation［J］.Nature，1997，386(6622):296-299.

［5］劉 卓，金 英，隋海娟，等.知母皂苷對(duì)Aβ25-35引起小腦顆粒細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制探討［J］.中成藥，2012，34(1):20-24.

［6］Hensley K，F(xiàn)loyd R A，Zheng N Y，et al.p38 kinase is activated in the Alzheimer's disease brain［J］.J Neurochem，1999，72(5):2053-2058.

［7］Munoz L，Ammit A J.Targeting p38MAPK pathway for the treatment of Alzheimer's disease［J］.Neuropharmacology，2010，58(3):561-568.

［8］李世章，金 英，楊 成，等.阿魏酸鈉對(duì)老年大鼠學(xué)習(xí)記憶能力改善作用及機(jī)制［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2012，28(2):294-295.

［9］閆恩志，金 英，范 瑩，等.阿魏酸鈉對(duì)淀粉樣β蛋白1-40引起的大鼠海馬MAP激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及凋亡蛋白表達(dá)的影響［J］.中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2007，21(5):385-392.

［10］閆恩志，范 瑩，金 英，等.吡格列酮對(duì)脂多糖引起的大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙及海馬炎癥反應(yīng)的影響［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2012，28(8):1068-1073.

［11］Dérijard B，Raingeaud J，Barrett T，et al.Independent human MAP-kinase signal transduction pathways defined by MEK and MKK isoforms［J］.Science，1995，267(5198):682-685.

［12］Stein B，Brady H，Yang M X，et al.Cloning and characterization of MEK6，a novel member of the mitogen-activated protein kinase kinase casade［J］.J Biol Chem，1996 ，271(19):11427-11433.

［13］Raingeaud J，Gupta S，Rogers J S，et al.Pro-inflammatory cytokines and environmental stress cause p38 mitogen-ativated protein kinase activation by dual phosphorylation on tyrosine and threonine［J］.J Biol Chem，1995，270(13):7420-7426.

［14］Schieven G L.The biology of p38 kinase:a central role in inflammation［J］.Curr Top Med Chem，2005，5(10):921-928.

［15］Lee J W，Lee Y K，Yuk D Y，et al.Neuro-inflammation induced by lipopolysaccharide causes cognitive impairment through enhancement of beta-amyloid generation［J］.J Neuroinflammtion，2008，29(5):37.

［16］Giovannini M G，Scali C，Prosperi C，et al.Beta-amyloid-induced inflammation and cholinergic hypofunction in the rat brain in vivo:involvement of the p38MAPK pathway［J］.Neurobiol Dis，2002，11(2):257-274.

［17］Akama K T，Van Eldik L J.Beta-amyloid stimulation of inducible nitric-oxide synthase in astrocytes is interleukin-1 beta-and tumor necrosis factor-alpha(TNF alpha)-dependent，and involves a TNF alpha receptor-associated factor-and NFkappaB-inducing kinase-dependent signaling mechanism［J］.J Biol Chem，2000，275(11):7918-7924.