血漿中莪術醇和吉馬酮的測定及其大鼠體內的藥代動力學研究

潘 瑜， 張 園， 向 錚 ， 嚴鵬程， 黃可新

(1.溫州醫(yī)學院藥學院，浙江溫州 325035;2.溫州醫(yī)學院分析測試中心，浙江溫州 325035)

莪術是姜科植物蓬莪術Curcuma phaeocaulisVal、廣西莪術Curcuma kwangsiensisS.G.Lee et C.F.Liang或溫郁金Curcuma wenyujinY.H.Chen et C.Ling，習稱溫莪術的干燥根莖［1］，具有行氣破血，消積止痛之功效，是一種活血化瘀類的傳統(tǒng)中藥。莪術的主要成分為揮發(fā)油和姜黃素，揮發(fā)油的主要成分是莪術醇、莪術二酮、吉馬酮等，其中莪術醇具有抗肝纖維化、抗氧化等生物活性［2］，也是發(fā)展前景良好的抗腫瘤藥物［3］。吉馬酮對D-半乳糖胺/脂多糖誘導的肝疾病具有保護作用［4］，是抗腫瘤的活性成分，對癌細胞有一定的抑制作用［5］。許多傳統(tǒng)復方制劑如木香分氣丸、止痛化癥膠囊、保婦康栓、痛經(jīng)寶顆粒［6］等都包含莪術;莪術也作為單味藥如莪術油等用于治療消積化滯、散結止痛、瘀血經(jīng)閉［6］。煎劑是中醫(yī)方劑用藥的基本形式，目前鮮有其煎劑的藥代動力學研究報道。本實驗建立了大鼠口服莪術水提物血漿中莪術醇和吉馬酮 (如圖1)的高效液相色譜法分析方法，此方法簡便、準確、穩(wěn)定，適用于莪術醇和吉馬酮的血藥濃度測定和藥動學研究。

圖1 莪術醇 (A)和吉馬酮 (B)的化學結構Fig.1 Structures of curcumenol and germacrone

1 材料與方法

1.1 儀器 Agilent 1100高效液相色譜系統(tǒng) (美國Agilent公司);XW-80A型漩渦混合器 (上海醫(yī)科大學儀器廠);Sartorius BS224S電子天平 (賽多利斯科學儀器 (北京)有限公司);TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司);FD-1C型冷凍干燥機(北京德天佑科技發(fā)展有限公司)。

1.2 藥品與試劑 莪術醇標準品 (中國藥品生物制品鑒定所，批號:100185-200506)，吉馬酮標準品(中國藥品生物制品鑒定所，批號:111665-200902)，甲醇、乙腈 (美國Spectrum公司，色譜純)，超純水 (Milli-Q系統(tǒng))，莪術 (溫州醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院中藥房提供)。

1.3 實驗動物 SD大鼠5只，雄性，6～7周齡，體質量 (250±20)g，溫州醫(yī)學院實驗動物中心提供。

1.4 給藥方案 莪術藥材經(jīng)水煎煮1 h后經(jīng)冷凍干燥成浸膏后4℃保存，給藥時用超純水配制成質量濃度為0.15 g/mL(浸膏中含莪術醇的量為0.276 mg/g，吉馬酮為0.164 mg/g)。SD大鼠 5只，禁食不禁水12 h，按照1 mL/100 g的劑量，灌胃給予莪術提取液。于灌胃后 0，0.083，0.167，0.333，0.5，1，2，4，8，12，24 h 尾靜脈取血每次約0.5 ml，置于肝素化管中，4℃靜置5 min，13 000 r/min離心10 min，分離血漿保存在-20℃。

1.5 色譜條件 Hypersil ODS色譜柱(4.6 mm×250mm，5 μm，大連依利特分析儀器有限公司)，流動相為乙腈-水 (0～20 min:63% ～66%)，體積流量為1.0 mL/min，柱溫25℃，檢測波長210 nm，進樣量20 μL。

1.6 血漿樣品處理 取血漿室溫下融凍，各精密吸取200 μL于離心管中，精密加入300 μL乙腈，渦旋1 min，離心 (13 000 r/min)15 min，取上清液，進樣20 μL作HPLC分析。

1.7 數(shù)據(jù)處理 利用藥理學計算軟件DAS 2.1.1版計算主要藥代學參數(shù)(t1/2、AUC等)。

2 結果

2.1 色譜行為 在1.5項色譜條件下，空白血漿、含藥血漿和含標準品血漿的色譜如圖2所示，各組分色譜峰充分分離，不受內源性雜質峰干擾，莪術醇的保留時間為10.095 min，吉馬酮的保留時間為13.595 min。

2.2 標準曲線 取莪術醇對照品和吉馬酮對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含莪術醇200 μg，吉馬酮200 μg的對照品貯備液。將上述配制好的莪術醇、吉馬酮對照品貯備液用甲醇依次稀釋成質量濃度分別為50，25，10，5，2.5，1，0.5，0.25，0.1，0.05 μg/mL。取大鼠空白血漿200 μL，精密加入上述配制好的莪術醇、吉馬酮對照品稀釋液，得到一系列不同質量濃度分別含莪術醇 5，2.5，1，0.5，0.25，0.1，0.05，0.025 μg/mL和 含 吉馬 酮 2.5，1，0.5，0.25，0.1，0.05，0.025 μg/mL。按照1.6項下進行操作。以血漿中待測物對照品質量濃度 (C)為橫坐標，相應峰面積 (Y)為縱坐標進行回歸計算，得標準曲線方程，如表1。

圖2 空白血漿 (A)、含標準品血漿 (B)及含藥血漿 (C)的HPLC色譜圖Fig.2 Chromatograms of blank plasma(A)，blank plasma spiked with curcumenol and germacrone(B)and plasma sample(C)

表1 莪術醇和吉馬酮的標準曲線、相關系數(shù)、線性范圍和定量限Tab.1 Standard curves，correlation coefficients，linear ranges and LOQs of curcumenol and germacrone

2.3 回收率和精密度 取空白血漿200 μL，精密加入已配制好的莪術醇和吉馬酮對照品溶液，配成高、中、低質量濃度，按照1.6項下進行操作，每一質量濃度進樣5次分析，計算求得其在大鼠血漿中的方法回收率、提取回收率，在1 d內不同時間進樣，測得3種質量濃度標準血漿的日內變異系數(shù)，相同質量濃度的標準血漿在5 d內的日間變異系數(shù)，結果如表2所示。

表2 莪術醇和吉馬酮在大鼠血漿中的回收率和精密度(±s，n=5)Tab.2 Recoveries and precisions of curcumenol and germacrone in rat plasma(±s，n=5)

表2 莪術醇和吉馬酮在大鼠血漿中的回收率和精密度(±s，n=5)Tab.2 Recoveries and precisions of curcumenol and germacrone in rat plasma(±s，n=5)

化合物 質量濃度/(μg·mL-1) 方法回收率/% 提取回收率/% 日內RSD/% 日間RSD/%5 95.8±1.08 95.9±2.46 1.43 1.68莪術醇 2.5 95.2±1.62 104.1±4.17 1.64 2.37 0.25 102.3±0.35 100.3±0.35 2.46 2.75 2.5 105.1±0.74 104.8±0.37 2.08 2.46吉馬酮0.25 103.6±0.44 96.3±1.05 3.05 3.12

2.4 穩(wěn)定性考察 制備高、中、低(含莪術醇5，2.5，0.25 μg/mL)的質控樣品，分別室溫放置12 h，反復凍融2次，-20℃凍存1 d，1周后測定。結果樣品在室溫放置12 h，凍融前，凍融1次，凍融2次，冷凍1 d和7 d后，測定的標準偏差均小于5%，穩(wěn)定性良好。

2.5 莪術醇和吉馬酮在大鼠體內的藥代動力學研究 血漿按照1.6項下進行操作，測得大鼠灌胃服用莪術水提液后的平均血藥濃度—時間曲線，結果見圖3。

利用藥理學計算軟件 DAS 2.1.1版處理，自動推算、模型、權重選擇，擬合的血藥濃度—時間曲線符合二室模型，有關藥動學參數(shù) (t1/2、AUC等)見表3。

3 討論

本實驗建立了RP-HPLC測定莪術醇和吉馬酮

圖3 莪術提取物大鼠灌胃給藥后莪術醇和吉馬酮的血藥濃度—時間曲線Fig.3 Mean plasma concentration-time curves of curcumenol and germacrone after intragastric administration of zedoary turmeric aqueous extract

表3 莪術醇和吉馬酮的藥動學參數(shù)Tab.3 Pharmacokinetic parameters of curcumenol and germacrone

在大鼠體內血藥濃度的方法，并進行了藥代動力學研究。根據(jù)紫外分光光度計測定，莪術醇的最大紫外吸收波長是207 nm，吉馬酮的最大紫外吸收波長是217 nm，二者在210 nm處均有較大吸收，故選擇此波長作為檢測波長。

中藥所含成分的復雜性、有效成分的不確定性以及成分微量等使分離測定的難度增加，血漿樣品處理的過程至關重要。莪術醇和吉馬酮為莪術中主要的活性成分，具有一定揮發(fā)性，其在氮氣揮干的過程中易損失導致定量結果不準確，因此實驗選用乙腈沉淀蛋白法代替乙酸乙酯萃取的方法處理血漿。

高效液相法的藥物體內分析，通常因提取方法對含量準確測定影響較大而采用內標法，但內標法測定操作過程較繁瑣，成本高。本實驗因在210 nm處內源性物質干擾較多，難以在較短的保留時間內選擇合適的內標物。此外，本實驗血樣處理操作簡單易行，經(jīng)方法學驗證，精密度較好，回收率高，故選擇外標法進行含量測定。

藥代動力學處理結果表明，大鼠灌胃服用莪術水提液后的藥代動力學過程用二室模型描述較為合理。莪術醇在胃腸道能迅速吸收(Kα=6.625 h-1)，灌服莪術提取液后莪術醇的血藥濃度在0.333 h達到峰值，說明莪術醇進入大鼠體循環(huán)后迅速分布(α=5.364 h-1)，發(fā)揮藥效迅速。血漿中莪術醇的消除速率常數(shù)β為0.121 h-1，血中的t1/2(α)=0.129 h，t1/2(β)=5.745 h，t1/2(β)＞t1/2(α)，可知大鼠灌服莪術提取液后莪術醇在體內消除也迅速，屬于吸收快、消除快的代謝過程。吉馬酮在胃腸道內吸收稍慢 (Kα=0.184 h-1)，灌服莪術提取液后吉馬酮的血藥濃度在1 h達峰，表明吉馬酮進入大鼠體循環(huán)后分布慢于莪術醇 (α=0.051 h-1)，血漿中吉馬酮的消除速率常數(shù)β為0.032 h-1，血中的t1/2(α)=13.633 h，t1/2(β)=22.002 h，提示大鼠灌服莪術提取液后吉馬酮屬于慢速消除類。莪術醇和吉馬酮的K12均大于K21，說明二者從中央房室向周邊房室的轉運速率大于從周邊房室向中央房室的轉運速率。表明莪術提取液大鼠灌胃后以不同速度從腸道吸收，進入體循環(huán)，隨機分布到體內的組織、器官，然后分別表現(xiàn)出不同的清除過程。

經(jīng)方法學驗證，本方法簡便、準確、穩(wěn)定，回收率、精密度均符合生物樣本中微量測定［7］要求，可用于莪術煎劑中藥代動力學研究。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2005年版一部［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2005:194.

［2］Lou Yan，Zhang Hui，He Hao，et al.Isolation and identification of phase 1 metabolites of curcumol in rats［J］.Drug Meta Dispos，2010，38(11):2014-2022.

［3］王 琰，王慕鄒.莪術的質量研究［J］.藥學學報，2001，36(11):849-853.

［4］Matsuda H，Ninomiya K，Morikawa T，et al.Inhibitory effect and action mechanism of sesquiterpenes fromZedoariae RhizomaonD-galactosamine/lipopolysaccharide-induced liver injury［J］.Bioorg Med ChemLett，1998，8(4):339-344.

［5］Zhong Zhangfeng，Chen Xiuping，Tan Wen，et al.Germacrone inhibits the proliferation of breast cancer cell lines by inducing cell cycle arrest and promoting apoptosis［J］.Eur J Pharmacol，2011，667(1-3):50-55.

［6］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

［7］Causon R.Validation of chromatographic methods in biomedical analysis.Viewpoint and discussion［J］.J Chromatogr B，1997，689(1):175-180.