脫氫卡維丁的腸道轉運特性研究

史月姣， 謝 輝*， 毛春芹， 張興德， 鄭雪平

(1.南京中醫藥大學，江蘇南京 210046;2.南京市中醫院，江蘇南京 210001)

巖黃連為罌粟科植物石生黃堇Corydalis saxicolaBunting的全草及肥大的根莖部，是黔、桂高寒山區珍貴的中藥材［1］。從巖黃連中分離得到生物堿類化合物具有降低血清轉氨酶活性、降低肝組織羥脯氨酸水平，抑制肝纖維化，減輕肝組織的病變程度等作用。脫氫卡維丁是巖黃連總生物堿中主要活性成分，具有鎮靜、鎮痛、解痙、抗菌和增加肝糖元生成的作用［2］。本研究采用大鼠外翻腸囊模型，考察巖黃連總生物堿中主要活性成分脫氫卡維丁在大鼠腸道的吸收特性，并采用人源結腸腺癌Caco-2細胞單層體外培養模型研究脫氫卡維丁的腸轉運特點以及轉運蛋白在其轉運中的作用，為巖黃連生物堿口服制劑研究提供試驗依據。

1 材料與儀器

1.1 藥物與試劑

脫氫卡維丁對照品 (批號111667-200401)、鹽酸維拉帕米對照品 (批號100223-200102)，均購自中國藥品生物制品檢定所，供含量測定用;巖黃連總生物堿 (本實驗室自制，含脫氫卡維丁10.16%);DMEM培養基 (南京凱基生物科技發展有限公司);胎牛血清 (Equitech-BioInc.公司);非必需氨基酸、HEPES粉末、谷氨酰胺、胰蛋白酶、Hank's平衡鹽粉末 (sigma公司);乙腈、甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑為分析純。

1.2 儀器

ALC-M離體組織器官試驗系統 (上海奧爾科特生物科技有限公司);二氧化碳培養箱(Hearous，德國);320型pH計 (Metller-Toledo分析儀器有限公司);Millicell-ERS跨膜電阻儀 (Millipore，美國);Transwell培 養 板 (NUNC，丹麥);Waters 515型高效液相色譜儀，2487紫外檢測器 (Waters，美國);Agilent 1200高效液相色譜儀，Agilent 6120單四極桿質譜檢測器(Agilent，美國);渦旋混合儀 (上海滬西分析儀器廠);高速臺式離心機 (上海安亭科學儀器廠)。

1.3 細胞

Caco-2 TC7細胞株，由法國 Moniqué Rousset博士饋贈。

1.4 動物

SD大鼠，雄性，體質量 (250±30)g，購自蘇州工業園區愛爾麥特科技有限公司，合格證號SCXK(蘇)2009-0001。

2 方法與結果

2.1 大鼠外翻腸囊模型試驗

2.1.1 巖黃連總生物堿溶液的配制 稱取巖黃連總生物堿適量，用新鮮配制的臺氏液溶解并定容，配制成巖黃連總生物堿質量濃度分別為0.03、0.06、0.10 mg/mL的高、中、低3個質量濃度的含藥臺氏液，其中脫氫卡維丁的質量濃度分別為3.05、6.10、10.16 μg/mL。

2.1.2 外翻腸囊試驗 參照文獻方法［3］，大鼠禁食 (不禁水)12 h，乙醚麻醉后沿腹中線開腹，小心地將大鼠腸管與腸系膜剝離，分別取十二指腸(幽門下1 cm為起始點)、空腸上段 (以幽門下15 cm為起始點)、回腸 (以盲腸上20 cm為起始點)各7 cm，放入37℃臺氏液中，沖洗至無內容物流出，小心剝離腸段表面的脂肪和血管。將腸段小心翻轉，使腸黏膜層在外，漿膜層在內，用手術線結扎一端，向囊內注入臺氏液400 μL后結扎另一端使之呈囊狀物，將其放入已有含藥臺氏液9 mL的麥氏浴槽中。試驗過程中保持37℃恒溫，并向浴槽中通入95%O2和5%CO2的混合氣體。分別在15、30、45、60 min取出腸段，用濾紙吸干黏膜面水分，吸取囊內液，測定其中脫氫卡維丁的含量，測量腸管的長與寬。

2.1.3 HPLC樣品分析 Agilent XDB C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm);流動相為乙腈-0.01 mol/L磷酸二氫鉀-水溶液 (18.5∶81.5);體積流量1.0 mL/min;檢測波長347 nm;柱溫30℃。色譜圖見圖1。

圖1 臺氏液中脫氫卡維丁測定HPLC圖Fig.1 HPLC chromatogramsofdehydrocavidine in Tyrode

方法學驗證:精密稱取脫氫卡維丁對照品10.30 mg，加甲醇溶解并定容至10 mL，制成1.03 mg/mL的脫氫卡維丁貯備液。精密量取貯備液適量分別配制成不同質量濃度的脫氫卡維丁對照品溶液，進樣分析，結果表明脫氫卡維丁在1.03～20.60 μg/mL范圍內，峰面積(Y)與質量濃度(X)呈良好線性關系，回歸方程為Y=35 578.096 1X-3 538.938 7，r=0.999 3。日內、日間精密度RSD均低于5%(n=6)，24 h穩定性RSD為2.23%，回收率為97.57%±0.45%。

精密吸取腸囊內液200 μL，于離心機中離心10 min(12 000 r/min)，取上清液進樣測定，以外標兩點法計算脫氫卡維丁的質量濃度。

2.1.4 數據分析 根據測定結果，計算脫氫卡維丁在各腸段的單位面積滲透量和表觀滲透系數。表觀滲透系數 (Papp)的計算公式如下［4］:

式中，dQ/dt為單位時間藥物滲透量 (ng/s)，A為腸囊表面積 (cm2)，C0為脫氫卡維丁的初始質量濃度 (ng/mL)。

脫氫卡維丁在大鼠各腸段的經時滲透曲線見圖2、圖3、圖4，各腸段表觀滲透系數見表1。試驗結果表明，隨著藥物質量濃度的增大，各腸段脫氫卡維丁的單位面積滲透量均有增加;相同的質量濃度下，各腸段脫氫卡維丁的單位面積滲透量隨著時間的延長而逐漸增加;十二指腸和空腸的單位面積滲透量比較接近，回腸的單位面積滲透量明顯較小。試驗質量濃度下同一部位腸段脫氫卡維丁表觀滲透系數無顯著性差異，十二指腸與空腸的表觀滲透系數無顯著性差異，回腸的表觀滲透系數較小。

圖2 脫氫卡維丁在大鼠十二指腸的滲透曲線Fig.2 Permeability curve of dehydrocavidine in rat's duodenum

圖3 脫氫卡維丁在大鼠空腸的滲透曲線Fig.3 Permeability curve of dehydrocavidine in rat's jejunum

2.2 Caco-2細胞單層模型試驗

2.2.1 藥物溶液的配制 精密稱取脫氫卡維丁10.59 mg，加入DMSO 2 mL，用超純水稀釋定容至10 mL作為貯備液。將貯備液用 HBSS溶液(pH7.4)稀釋至質量濃度為6.99 ng/mL(即20.0 μmol/L)的脫氫卡維丁溶液。

圖4 脫氫卡維丁在大鼠回腸的滲透曲線Fig.4 Permeability curve of dehydrocavidine in rat's ileum

表1 脫氫卡維丁在大鼠各腸段的表觀滲透系數Tab.1 Apparent permeability coefficient of dehydrocavidine in rat's intestine

精密稱取鹽酸維拉帕米對照品適量，與上述脫氫卡維丁對照品貯備液用HBSS(pH7.4)溶解并配制成含鹽酸維拉帕米的脫氫卡維丁溶液，其中脫氫卡維丁的質量濃度為6.99 ng/mL，鹽酸維拉帕米為9.80 ng/mL。

2.2.2 雙向跨膜轉運試驗 參考文獻 ［5-7］，建立Caco-2細胞單層模型。試驗前首先用37℃預熱的Hank's平衡鹽溶液 (HBSS，pH7.4)溶液洗滌細胞單層3次，用跨膜電阻儀檢測跨膜電阻，各孔跨膜電阻值均大于空白對照值100 hm/4.2 cm2以上，即符合實驗要求可用于試驗。加入預熱的HBSS(pH7.4)溶液，于37℃搖床中孵育1 h，吸棄HBSS(pH7.4)溶液。

脫氫卡維丁從A側到B側的轉運:將脫氫卡維丁溶液加至細胞絨毛面Apical(A)側為供給液，同時將空白HBSS(pH7.4)溶液加至細胞基底面Basolateral(B)側作為接收液，將Transwell培養板置于轉速為50 r/min的37℃恒溫搖床中，分別在0、1、2、3、4 h吸取供給池、接收池溶液各400 μL待測，同時補加等容積相應的溶液。

脫氫卡維丁從B側到A側的轉運:將脫氫卡維丁溶液加至B側作為供給液，空白的HBSS(pH7.4)溶液加至A側作為接收液，其余操作與上述從A側到B側的轉運相同。

鹽酸維拉帕米對脫氫卡維丁雙向跨膜轉運的影響:對含鹽酸維拉帕米的脫氫卡維丁溶液按上述操作進行雙向跨膜轉運試驗。

2.2.3 HPLC/MS樣品分析 Sapax BR-C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.8 μm)(蘇州賽分科技有限公司);Sapax BR-C18保護柱 (2.0 mm×10 mm，1.8 μm)(蘇州賽分科技有限公司);流動相為0.1%甲酸-甲醇 (70∶30);體積流量0.2 mL/min;柱溫30℃。

質譜條件:ESI;工作模式:SIM;m/z350;裂解電壓150 V;毛細管電壓3 000 V;噴霧器壓力206.82 kPa;脫溶劑溫350℃;脫溶劑氣體體積流量480 L/h。色譜圖見圖5。

圖5 HBSS中脫氫卡維丁測定HPLC/MS圖Fig.5 HPLC/MS chromatograms of dehydrocavidine in HBSS

方法學驗證:精密量取脫氫卡維丁貯備液適量分別稀釋配制成不同質量濃度的脫氫卡維丁對照品溶液，進樣分析。結果表明，脫氫卡維丁在0.10～105.90 ng/mL范圍內，峰面積值 (Y)與質量濃度 (X)呈良好的線性關系，回歸方程為Y=420.423 3X+7.387 1，r=0.999 9。日內、日間精密度RSD均低于2%(n=6)，24 h穩定性RSD為1.10%，回收率為98.33%±0.71%。

在上述轉運試驗取樣溶液中，精密加入甲醇400 μL，渦旋混勻，于離心機中12 000 r/min離心15 min，取上清液進樣測定，以外標兩點法計算脫氫卡維丁的質量濃度。

2.2.4 數據分析 計算各時間點的累計轉運量，并按2.1.4項下公式計算表觀滲透系數，公式中A為轉運膜的面積4.2 cm2。

脫氫卡維丁雙向累計轉運量隨時間的變化見圖6，表觀滲透系數測定結果見表2。

圖6 脫氫卡維丁1-4 h跨膜轉運量Fig.6 Cumulative transport amount of dehydrocavidine in 1-4 hours

表2 脫氫卡維丁的雙向轉運行為及鹽酸維拉帕米對其轉運的影響Tab.2 Bi-directional transport characteristics of dehydrocavidine and the influence of transport by verapamil hydrochloride

試驗結果表明，隨著時間延長，脫氫卡維丁的累計轉運量逐漸增加，兩者間呈較好的正相關性。脫氫卡維丁從B側到A側的滲透系數即分泌滲透系數 (PBA)比其吸收滲透系數PAB大 (P＜0.05)，兩者均值的比值即外排比率PBA/PAB＞4，提示脫氫卡維丁在小腸吸收轉運的過程中存在載體的外排作用。

Caco-2細胞單層頂側膜上有豐富的P-gp的表達，鹽酸維拉帕米為P-gp抑制劑，鹽酸維拉帕米能顯著促進脫氫卡維丁通過Caco-2單層細胞模型的A到B側的轉運量。加入鹽酸維拉帕米后，脫氫卡維丁的吸收滲透系數增加了2.68倍，脫氫卡維丁在Caco-2細胞模型中的外排比率比未加鹽酸維拉帕米的對照組下降了75.56%，提示脫氫卡維丁在Caco-2細胞單層中的轉運存在P-gp的外排作用。

3 討論

口服給藥系統設計中，活性成分在腸道的轉運是影響生物利用度的重要因素。本研究首先采用外翻腸囊模型考察不同質量濃度巖黃連生物堿中脫氫卡維丁在大鼠不同腸段的轉運特性。預試驗發現巖黃連總生物堿在臺氏液中質量濃度超過0.1 mg/mL時不能完全溶解，為避免對試驗結果產生影響，最高質量濃度選擇0.1 mg/mL，結合藥效試驗劑量，最低質量濃度選擇0.03 mg/mL。通過試驗發現巖黃連總生物堿中脫氫卡維丁在不同部位的離體腸囊內均有吸收，但表觀滲透系數均較小。脫氫卡維丁在回腸的滲透性小于十二指腸與空腸。試驗質量濃度下，同一部位腸段脫氫卡維丁表觀滲透系數無顯著性差異，表現出被動轉運的特征。

腸壁細胞膜內側存在的藥物外排泵如P-gp和MRP等，能將藥物從腸漿膜轉到腸黏膜而排入腸腔，從而導致藥物吸收量減少。本項目前期研究制得的巖黃連提取物中生物堿類成分占56.89%，通過紫外光譜、高分辨質譜及二級質譜分析，結果表明其中含多種原小檗堿類化合物，主要包括脫氫卡維丁、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿等。文獻研究顯示，鹽酸巴馬汀與鹽酸小檗堿在腸道的轉運均受P-gp外排作用影響［8-10］，這兩種成分的量在制備的提取物中僅次于脫氫卡維丁。為了考察P-gp是否影響同為原小檗堿型生物堿的脫氫卡維丁的腸道轉運，本實驗采用Caco-2細胞單層模型進一步研究脫氫卡維丁雙向跨膜轉運行為。轉運蛋白多具有飽和性，本研究在設定濃度時，選用了較低的藥物濃度 (20 μmol/L)，避免了可能存在的外排蛋白被飽和現象對結果的影響。脫氫卡維丁在試驗濃度下轉運4 h試驗結束后未見細胞跨膜電阻下降，說明在該濃度條件下不會出現細胞毒性。通過研究P-gp抑制劑鹽酸維拉帕米添加前后脫氫卡維丁雙向轉運行為的變化，發現脫氫卡維丁在Caco-2細胞單層中的轉運存在P-gp的外排作用。

根據試驗結果，分析認為脫氫卡維丁的腸黏膜轉運存在轉運蛋白的外排機制，但在提取物中多種生物堿組分共存條件下，因轉運蛋白外排的飽和而呈現一定的被動轉運特征。其他膜轉運蛋白在脫氫卡維丁跨膜轉運過程中的影響有待進一步研究。

［1］中國科學院廣西植物所.廣西植物志［M］.南寧:廣西科學技術出版社，1993:410.

［2］陳重陽，趙 一.中藥巖黃連主要成分脫氫卡維丁的藥理研究［J］.中藥通報，1982，2:31-34.

［3］魏 偉，吳希美，李元建，主編.藥理實驗方法學 (第4版)［M］.北京:人民衛生出版社，2010，526.

［4］Artursson P，Karlsson J.Correlation between oral drug absorptionin in humans and apparent drug permeability coefficients in human intestinal epithelial(Caco-2)cells［J］.Biochem Biophys Res Commun，1991，175(3):880-885.

［5］Hu M，Chen J，Tran D，et al.The Caco-2 cell monolayers as an intestinal metabolism model:metabolism of dipeptide PhePro［J］.Drug Target，1994，2:79-89.

［6］Hu M，Chen J，Zhu Y，et al.Mechanism and kinetics of transcellular transport of a new β-actam antibiotic loracarbef across a human intestinal epithelial model system(Caco-2)［J］.Phrm Res，1994，11:1405-1413.

［7］陳 彥，賈曉斌，胡 明，等.淫羊藿苷在Caco-2細胞單層模型中的吸收機制［J］.中國中藥雜志，2008，33(10):1164-1167.

［8］張新峰，裘福榮，蔣 健，等.LC-MS/MS測定藥根堿、巴馬汀和小檗堿在Caco-2細胞的攝取特性［J］.中國藥學雜志，2010，45(19):1504-1508.

［9］Maeng H J，Yoo H J，Kim I W，et al.P-glycoprotein-mediated transport of berberine across Caco-2 cell monolayers［J］.J Pharm Sci，2002，91:2614-2621.

［10］PanG Y，Wang G J，LiuX D，et al.The involvement of P-glycoprotein in berberine absorption［J］.Pharmacol Toxicol，2002，91:193-197.