粒細胞集落刺激因子治療急性腦梗死的療效及安全性研究

周育苗，吳 炯，劉小利，李雅國

腦梗死是發病率較高的疾病之一，目前公認的有效治療方法是溶栓治療，但由于各種原因，僅有10%～18%的急性腦梗死患者接受了溶栓治療［1］。干細胞具有自我復制和多向分化的潛能，在神經系統領域的應用越來越受到關注。業已證明，在成人腦室下區和海馬齒狀回存在神經干細胞，當大腦細胞受損時可能遷移至病灶區并分化為神經元和膠質細胞［2］，但這種自我挽救的能力非常有限。可喜的是，這種神經發生可以被一些外源性信號因子增強，如成纖維生長因子、血管內皮生長因子、腦源性營養因子和粒細胞集落刺激因子 (granulocyte colony － stimulating factor，G － CSF)［3］。

目前已有較多的動物實驗證實皮下注射G－CSF可減小腦梗死的體積并改善預后［4］，但臨床試驗報道并不多;因各試驗G－CSF的劑量不一，從發病到入組的時間以及基線腦梗死體積不同等因素，導致各試驗的結論不一致，需進一步探索。本研究在現有試驗的基礎上觀察G－CSF治療急性腦梗死的有效性和安全性及外周血細胞數的變化。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇2011—2012年在我院神經內科住院的患者。病例入選標準:首次發生的大腦中動脈區梗死，發病7 d內，癱瘓側肢體肌力≤Ⅲ級，MRI檢查示梗死體積＞15 ml。病例排除標準:因意識障礙或失語不能配合者，入組前伴感染者〔可能導致白細胞計數 (WBC)升高〕，伴血液系統疾病或凝血功能異常者 (包括血小板計數減少)，腦梗死伴出血者，重要臟器功能衰竭者，惡性腫瘤者，因各種原因不能應用G－CSF者，住院期間發生嚴重感染者。本試驗符合浙江醫院倫理委員會制定的倫理學標準，受試者均充分了解整個試驗過程及可能出現的不良反應，并簽署知情同意書。

1.2 試驗設計及給藥方案 采用前瞻性研究，按照隨機數字表法分為試驗組 (G－CSF組)和對照組，負責隨訪的課題組成員對分組情況不知情。兩組受試者均按照2010年中華醫學會神經病學分會制定的卒中指南給予常規治療。G－CSF組在常規治療的基礎上皮下注射G－CSF(吉粒芬，杭州九源基因工程有限公司，批號20110204)300 μg/次，2次/d(每天8:00、20:00)，共5 d;如果WBC達到或超過50×109/L，則改為1次/d，皮下注射。對照組在常規治療的基礎上給予0.9%氯化鈉溶液2 ml皮下注射，2次/d(每天8:00、20:00)，共5 d。

1.3 實驗室檢查指標 G－CSF組每天6:00抽血，連續8 d，按給藥時間標記為第1～8天。因抽血時間是在6:00而給藥時間是在8:00，所以第1天的血標本是給藥前的，第2天的血標本是給藥1 d后的，以此類推，第6天的血標本是給藥5 d后的。其他檢測指標為血常規、凝血功能+D－二聚體、肝腎功能和胞數。因為皮下注射0.9%氯化鈉溶液不會對血常規、凝血功能及肝腎功能等指標產生影響，所以對照組僅在第1天檢查上述指標。

1.4細胞數計數方法 按照ProCOUNT試劑盒 (Becton Dickinson公司生產，美國)說明書操作，簡述如下:使用反向取樣技術向2支TruCount管中分別加入細胞數檢測試劑和對照試劑各20 μl，然后各加入全血標本50 μl，避光室溫孵育15 min，隨后各加入450 μl FACS紅細胞裂解液 (Becton Dickinson公司生產，美國)，避光室溫孵育30 min后放入FACSC alibur流式細胞分析儀 (Becton Dickinson公司生產，美國)，程序設定好后儀器會自動給出細胞數的絕對值(個/μl)。

1.5 臨床觀察指標 (1)安全性:記錄整個試驗過程中發生的任何不良事件，重點關注以下信息:肝腎功能，血小板計數，凝血功能，發熱，皮疹，胃腸道反應，血栓性栓塞事件，肌肉、關節和骨骼疼痛。(2)有效性:比較兩組入組時及入組1、2、3個月時美國國立衛生研究院卒中量表 (NIHSS)評分和日常生活能力評定量表 (Barthel指數)評分。Barthel指數評分分級標準:75～90分為輕度殘疾，50～70分為中度殘疾，25～45分為重度殘疾;0～20分為極重度殘疾。

1.6 統計學方法 采用SPSS 13.0統計軟件包進行統計學分析，連續性資料以 (±s)表示，非連續性資料 (如年齡)用中位數 (四分位數間距)〔M(QR)〕表示，計數資料用相對數表示。計量資料的組間比較采用成組t檢驗 (數據均服從正態分布)，組內比較采用重復測量的方差分析。等級資料的比較采用秩和檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 基線資料 最終納入統計的受試者共82例，對照組42例，G－CSF組40例，兩組均完成3個月隨訪，無死亡及脫落者。平均住院時間為 (36±5)d，所有患者病情穩定后行正規康復治療。兩組患者的基線資料間差異無統計學意義 (P＞0.05，見表1)。

2.2 實驗室檢查結果 皮下注射G－CSF之前 (第1天)，兩組胞數、WBC、PLT、肝腎功能、凝血功能指標間差異均無統計學意義 (P＞0.05，見表2)。

2.3 NIHSS評分和Barthel指數評分分級比較 第1天和入組1個月兩組NIHSS評分間差異無統計學意義 (P＞0.05)，入組2、3個月兩組間差異有統計學意義 (P＜0.05，見表4)。兩組不同時間點Barthel指數評分分級間差異均無統計學意義(P＞0.05，見表5)。

2.4 不良事件 G－CSF組發生胃腸道反應19例 (47.5%)，包括惡心、嘔吐、胃痛和厭食;骨骼肌肉疼痛15例(37.5%)和發熱12例 (30.0%)，疼痛均為輕中度，沒有因此而停藥，發熱體溫最高者為38.6℃，只應用酚氨加敏退熱處理;1例患者在住院第26天時發生左腋靜脈堵塞導致左上肢腫脹，用尿激酶溶栓后好轉，后又發生急性心肌梗死，轉心內科治療，預后良好。對照組未發生血栓性栓塞事件。

表4 兩組不同時間點NIHSS評分比較 (±s，分)Table 4 Comparison of NIHSS scores between two groups in different times

表4 兩組不同時間點NIHSS評分比較 (±s，分)Table 4 Comparison of NIHSS scores between two groups in different times

組別 例數 第1天 入組1個月入組2個月入組3個月對照組42 11.0±2.6 9.1±1.8 7.5±0.9 6.5±0.8 G－CSF組 40 11.4±2.5 8.5±1.7 6.4±1.0 5.5±0.6 t 值0.49 －0.99 －2.91 －4.12 P值0.63 0.33 0.01 0.00

表1 兩組患者的基線資料比較Table 1 Comparison of baseline characteristics between two groups

表2 兩組第1天實驗室檢查指標比較 (±s)Table 2 Comparison of laboratory results between two groups in first day

表2 兩組第1天實驗室檢查指標比較 (±s)Table 2 Comparison of laboratory results between two groups in first day

注:WBC=白細胞計數，PLT=血小板計數，ALT=丙氨酸氨基轉移酶，Scr=血肌酐，APTT=活化部分凝血活酶時間，PT=凝血酶原時間，Fib=纖維蛋白原

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表3 試驗組第1～8天實驗室檢查指標比較 (±s)Table 3 Comparison of the laboratory indexes in G－CSF group from the first day to the eighth day

表3 試驗組第1～8天實驗室檢查指標比較 (±s)Table 3 Comparison of the laboratory indexes in G－CSF group from the first day to the eighth day

注:與其他時間點比較，*P＜0.05;與第6天比較，△P＜0.05

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表5 兩組不同時間點Barthel指數評分分級比較〔n(%)〕Table 5 Comparison of Barthel Index score grade between two groups in different times

3 討論

腦梗死發病后48 h就可以在梗死區及其周邊的神經元檢測到G－CSF受體［5］，Dunac等［6］發現腦梗死患者外周血細胞數明顯升高，而且升高幅度越大的患者預后越好。由此推測G－CSF可能是通過動員細胞起神經保護作用的，并開展了G－CSF治療腦梗死的臨床試驗。Schabitz等［7］入組了44例發病12 h內的腦梗死患者，G－CSF持續72 h靜脈給藥，總體上沒有觀察到治療組和對照組臨床結局的差異，但亞組分析顯示梗死體積＞14～17 ml者應用G－CSF能改善預后，而且G－CSF劑量越大，獲益越多。據此，本研究選擇了梗死體積＞15 ml的大腦中動脈區梗死患者82例，隨機分為G－CSF組(40例)和對照組 (42例)，結果發現G－CSF組NIHSS評分下降明顯，兩組在入組2個月時差異有統計學意義，與Shyu等［8］結果類似。

從Barthel指數評分分級層面分析，兩組間未發現統計學差異，神經功能層面和Barthel指數評分分級結果的不一致說明有些患者雖然神經功能改善，但沒有達到能改善日常生活能力的程度。入組3個月時，G－CSF組極重度殘疾患者所占的比例下降明顯，提示G－CSF可能對病情嚴重的患者更有優勢，與Schabitz等［7］的結果相似 (腦梗死面積較大的患者應用G－CSF療效較明顯)。國內幾項臨床試驗表明，應用G－CSF不僅能減輕神經功能缺損程度，而且對日常生活能力也有明顯改善，但沒有進一步分析G－CSF對哪些患者更有效，特別是沒有對腦梗死的體積進一步行亞組分析［9－11］。Sprigg 等［12］則認為皮下注射G－CSF并不能改善腦梗死患者3個月的結局，但其入組的是卒中發病后7～28 d的患者，本研究為發病7 d內的患者。

實驗室檢查指標方面，本研究重點觀察了外周血細胞數的變化。CD34分子是一種跨膜糖蛋白，選擇性地表達于造血干/祖細胞表面，并隨細胞的成熟逐漸減弱至消失。本研究顯示細胞數隨著G－CSF應用時間的增加而升高，停用G－CSF后迅速下降，說明G－CSF確實能動員骨髓造血干細胞進入外周血從而進入大腦，但能否透過血－腦脊液屏障進而分化為成熟的神經細胞尚待檢驗。Sprigg等［12］也觀察到類似結果，而且證實G－CSF劑量越大、應用次數越多外周血細胞數越多，最大劑量組 (10 μg/kg，皮下注射，1次/d，×5 d)細胞數峰值為37.7個/μl，高于本試驗22.4個/μl的峰值。值得注意的是，本研究觀察到G－CSF組D－二聚體明顯升高，而且停用G－CSF后至少3 d內仍在升高，說明體內存在頻繁的血栓形成和溶解過程，提示G－CSF組血栓栓塞事件可能多于對照組，觀察顯示大部分患者并沒有出現臨床癥狀和體征，分析原因可能是由于WBC升高增加了血液黏稠度導致血液容易凝固，從而導致了繼發性纖溶亢進，目前國內外尚沒有類似報道。與Schabitz等［7］研究結果一致，本研究也觀察到了ALT有升高趨勢，PLT有一定程度的下降，但均在參考范圍內，臨床沒有觀察到出血事件的增加。

Floel等［13］的研究是目前發表的惟一針對慢性腦梗死的臨床試驗，對發病4個月后的慢性腦梗死患者皮下注射G－CSF，重點觀察安全性和有效性。結果發現G－CSF組不良事件發生率高于對照組，但均為輕中度的且均是G－CSF說明書上提及的不良反應，本研究結果與其一致。不同的是本研究G－CSF組有1例患者反復發生靜脈性和動脈性血栓栓塞事件，不能確定是否與應用G－CSF導致WBC升高有關。雖然幾乎所有試驗報道了G－CSF不增加血栓栓塞事件，但本研究發現G－CSF組D－二聚體水平逐漸升高，提示機體內存在較活躍的反復的血栓形成和溶解過程，這一點仍然值得重視。

總之，發病7 d內且梗死體積＞15 ml的缺血性腦卒中患者皮下注射G－CSF(300 μg/次，2次/d)能改善預后，但可能增加血栓栓塞事件的風險。其機制可能是通過動員骨髓造血干/祖細胞進入外周血從而促進新生血管的形成、抗神經細胞凋亡和促進新神經元的發生。

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3 Lee ST，Chu K，Jung KH，et al.Granulocyte colony － stimulating factor enhances angiogenesis after focal cerebral ischemia［J］.Brain Res，2005，1058(1/2):120 －128.

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5 Hasselblatt M，Jeibmann A，Riesmeier B，et al.Granulocyte－colony stimulating factor(G－CSF)and G－CSF receptor expression in human ischemic stroke［J］.Acta Neuropathol，2007，113(1):45 －51.

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7 Schabitz WR，Laage R，Vogt G，et al.AXIS:a trial of intravenous granulocyte colony －stimulating factor in acute ischemic stroke［J］.Stroke，2010，41(11):2545 －2551.

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12 Sprigg N，Bath PM，Zhao L.Granulocyte－colony－stimulating factor mobilizes bone marrow stem cells in patients with subacute ischemic stroke:the Stem cell Trial of recovery Enhancement after Stroke(STEMS)pilot randomized，controlled trial［J］.Stroke，2006，37(12):2979 －2983.

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