響應面法優化提取銀杏雄株葉片聚戊烯醇的工藝研究

吳秋月， 陳 鵬， 仲月明， 周長遠， 沈丹紅， 蔣 菲

(揚州大學園藝與植物保護學院，江蘇揚州225009)

銀杏聚戊烯醇是銀杏Ginkgo bilobaL.葉中重要藥用和保健有效成分，是人體合成具廣泛重要生理作用的多萜醇及其衍生物的中間體，經代謝形成多萜醇后可補充體內多萜醇的不足，不僅可提高免疫功能、抑制癌細胞轉移、促進肝細胞再生［1-2］，而且還可改善膜的流動性、穩定性和滲透性，從而增強膜的融合［3-4］。這些藥用價值使銀杏聚戊烯醇更加凸顯成為具重要開發利用價值的生物活性成分。

目前銀杏雌株主要用于結實生產種核，銀杏雄株由于其生殖特性成為主要的葉用資源［5］。銀杏葉聚戊烯醇相對黃酮類和萜內酯類化合物的量較高［6］，但由于其提取工藝復雜、成本高等，使其開發利用進展不及黃酮類和萜內酯類化合物。銀杏聚戊烯醇是由一系列異戊烯基單元和終端異戊烯醇單元組成的一類線形類脂化合物［7］，極性很弱，因此可使用非極性或弱極性溶劑來提取。而提取中溶劑類型、料液比、提取時間等顯著影響聚戊烯醇得率。各個重要影響因子的不同水平處理的提取體系已見有采取正交設計法進行優化選擇的報道［8］。為了進一步開發利用銀杏雄株資源，本研究采用響應面 (Response Surface Methodology，RSM)法優化超聲提取銀杏雄株葉片聚戊烯醇，以期為銀杏葉片聚戊烯醇的提取利用提供理論依據與應用技術。

1 材料與方法

1.1 葉片采集與處理

取自揚州大學銀杏園內25株13年生雄株，栽培管理一致，生長發育良好。分別于2011年6月～10月平均采集供試雄株樹冠內、中、外以及雄株上、中、下的葉片，每株采集200片葉。銀杏葉片采摘后洗凈、瀝干，放入烘箱內105℃殺青30 min，80℃烘至水分在10%以下，粉碎過80目篩，置于塑料袋內密封后于-40℃冰箱儲存備用。

1.2 實驗儀器與試劑

實驗儀器:KQ—500B超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司;旋轉蒸發儀 (RE—5299)，上海亞榮生化儀器有限公司;Shimadzu LC-10A高效液相色譜儀，日本島津公司;紫外檢測器 (SPD—10A)，日本島津公司;電熱恒溫鼓風干燥箱(DGG—9240A型)，上海森信實驗儀器有限公司;高速冷凍離心機 (GL—21M)，長沙平凡儀器儀表有限公司。

實驗試劑:聚戊烯醇C85對照品、C90對照品、C95對照品，購自瑞典Larodan公司。石油醚、正己烷、乙酸乙酯等試劑均為分析純，200～300目硅膠，HPLC用甲醇、異丙醇、正己烷為色譜純，HPLC用水為超純水，其他用水為雙蒸水。

1.3 銀杏葉聚戊烯醇的提取

準確稱取銀杏雄株葉粉末3 g，加入提取溶液用超聲波法提取，提取一段時間后過濾，然后進行皂化反應 (5%氫氧化鈉甲醇溶液，料液比1∶3，超聲2.5 h，溫度45℃)，取上層黃色澄清液體，旋轉蒸發濃縮，硅膠柱層析 ［5 g硅膠干法裝柱，石油醚-乙酸乙酯 (9∶1)洗脫，收集20 mL］，旋轉蒸發濃縮，溶解于2 mL的正己烷中，得聚戊烯醇的提取物以供HPLC檢測。

1.4 HPLC檢測

1.4.1 高效液相色譜條件 十八烷基硅烷鍵合硅膠柱色譜柱 (150 mm×6.0 mm，5 μm);柱溫為30℃;流動相為異丙醇 -甲醇 -正己烷 -水(50∶25∶10∶2);體積流量為1 mL/min;檢測波長為215 nm;進樣量為10 μL。HPLC圖譜見圖1。

1.4.2 聚戊烯醇標準曲線的制作 王成章曾采用四種聚戊烯醇標準品測試樣品，發現不同鏈長的聚戊烯醇標準品，對樣品測試結果的相對標準誤差小于3%，因此，在HPLC定量分析時，可以認為不同鏈長的聚戊烯醇對應的各色譜峰具有相同的響應因子［17］，所以本實驗選擇其中一種聚戊烯醇C90-Prenol作為外標物，以建立聚戊烯醇的HPLC的定量方法，從而對樣品進行定量分析。

圖1 不同聚戊烯醇對照品和供試樣品色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances and the samples

取對照品C90-Prenol 0.02 g，精密稱定，用正己烷溶解，置于100 mL量瓶中，定容至刻度，得C90-Prenol標準貯備液 (0.20 mg/mL)。用移液管分別取C90-Prenol標準貯備液 5、10、20、40 mL，用正己烷定容至 50 mL量瓶，得 0.02、0.04、0.08、0.16 mg/mL的標準溶液，分別取各標準溶液和貯備液進樣10 μL，測定其峰面積。以對照品濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線并得到聚戊烯醇線性回歸方程及相關系數為:Y=5×10-7X-2.950 6，R2=0.998 7。

式中:s1、s2、s3分別為 HPLC中 C85、C90、C95聚戊烯醇的峰面積;

A為標準曲線回歸方程的斜率;B為標準曲線回歸方程的截距;n為稀釋倍數;v為樣品體積;m為銀杏雄株葉片質量。

1.5 銀杏雄株葉片聚戊烯醇超聲提取的主要影響因子及其處理水平的確定

影響銀杏雄株葉片聚戊烯醇提取的因子有很多，綜合國內外文獻資料比較得出，銀杏雄株葉片聚戊烯醇提取的主要影響因子有提取溶劑的類型、超聲提取的料液比、溫度和時間，因此先設計確定提取溶劑類型的實驗并在此基礎上設計以料液比、時間、溫度為因子的單因素試驗，考察各因素對銀杏雄株葉片聚戊烯醇得率的影響。

1.5.1 提取溶劑的確定 精密稱取預處理好的銀杏雄株葉片粉末3 g共9份，分為3組，每組3個平行樣，分別用正己烷、石油醚、乙酸乙酯進行超聲提取，料液比1∶10 g/mL，超聲時間30 min，溫度40℃。比較得率，以確定最佳提取溶劑。

1.5.2 料液比對銀杏雄株葉片聚戊烯醇得率的影響在本實驗中，料液比是銀杏雄株葉片質量與提取所用的溶劑的體積的比值。精密稱取3 g銀杏雄株葉片粉末5份，在40℃條件下，分別采用1∶10、1∶12、1∶14、1∶16、1∶18的料液比，重復3次，超聲30 min以比較不同料液比對提取銀杏葉聚戊烯醇的影響。

1.5.3 超聲波時間對銀杏雄株葉片聚戊烯醇得率的影響 精密稱取3 g銀杏雄株葉片粉末5份，在料液比1∶10，溫度40℃的條件下分別用15、30、45、60、75 min超聲波時間進行超聲波浸提聚戊烯醇，重復3次，考察不同超聲波時間對銀杏雄株葉片聚戊烯醇得率的影響。

1.5.4 溫度對銀杏雄株葉片聚戊烯醇得率的影響精密稱取3 g銀杏雄株葉片粉末5份，在料液比1∶10，超聲時間為30 min的條件下下分別用20、30、40、50、60℃的超聲溫度進行超聲波浸提聚戊烯醇，重復3次，考察不同超聲提取溫度對銀杏雄株葉片聚戊烯醇得率的影響。

1.6 Box-Behnken試驗設計

在以上單因素實驗的基礎上，根據Box-Behnken的中心組合試驗設計原理［9-10］。選取影響銀杏雄株葉片聚戊烯醇得率的三個主要因素料液比、時間、超聲溫度進行優化組合。試驗因素水平安排見表1。

表1 Box-Behnken試驗設計因素水平Tab.1 Experimental levels of factors in Box-Behnken design

2 結果與分析

2.1 銀杏雄株葉片聚戊烯醇超聲提取的主要影響因子及其處理水平的確定

2.1.1 提取溶劑的確定 提取溶劑的種類是影響聚戊烯醇提取的重要因素之一，按照1.5.1項的方法考察了石油醚、正己烷和乙酸乙酯3種不同的溶劑對銀杏雄株葉片聚戊烯醇得率的影響，實驗數據用SPSS軟件處理后結果如表2所示:石油醚、正己烷、乙酸乙酯均可用于聚戊烯醇的提取，其中正己烷的提取率顯著高于石油醚和乙酸乙酯，而石油醚和乙酸乙酯之間沒有顯著差異，因此綜合考慮得率及各種溶液的成本，本實驗以正己烷作為提取溶劑。

表2 不同溶劑對聚戊烯醇得率的影響 (n=3)Tab.2 Effect of different solvents on yield of polyprenols(n=3)

2.1.2 料液比對銀杏雄株葉片聚戊烯醇提取率的影響 按照1.5.2項的方法考察不同料液比對銀杏雄株葉片聚戊烯醇得率的影響，重復3次 (n=3)，不同處理下聚戊烯醇的得率見圖2。由圖可知，隨著料液比的增大，銀杏葉聚戊烯醇的得率逐漸增大，當料液比超過1∶14 g/mL時，聚戊烯醇得率不再上升，反而有所下降。這說明料液比對聚戊烯醇的提取影響較顯著，并非簡單的正相關關系，因此，超聲波提取銀杏葉聚戊烯醇的料液比初步確定為1∶14 g/mL。

2.1.3 超聲波時間對銀杏雄株葉片提取率的影響按照1.5.3項的方法考察不同超聲波時間對銀杏雄株葉片聚戊烯醇得率的影響，重復3次 (n=3)，結果如圖3所示。由圖可知，銀杏雄株葉片聚戊烯醇的得率隨著時間的增加呈現先上升再下降的總體趨勢，當提取時間為45 min時，得率達到最大。這說明，提取時間對聚戊烯醇的得率有比較顯著的影響，時間過短，提取不充分，時間過長，可能引起很多其他雜質也逐漸溶出，導致得率降低。因此，超聲時間初步確定為45 min。

圖2 料液比對聚戊烯醇得率的影響Fig.2 Effect of liquid to material ratio on yield of polyprenols

圖3 超聲提取時間對聚戊烯醇得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic extraction time onyield of polyprenols

2.1.4 溫度對銀杏雄株葉片聚戊烯醇得率的影響按照1.5.3項的方法考察不同超聲提取溫度對銀杏雄株葉片聚戊烯醇得率的影響，重復3次 (n=3)，結果如圖4所示。由圖可知，隨著溫度的上升，聚戊烯醇得率逐漸增大，在40℃時，聚戊烯醇得率達到最大，超過40℃聚戊烯醇得率就逐漸下降，這可能是由于溫度越高，越有利于聚戊烯醇溶出，但是溫度過高可能就會破壞聚戊烯醇的結構。因此，超聲提取中控制溫度初步確定為40℃。

2.2 銀杏雄株葉片聚戊烯醇響應面法提取優化設計

以料液比、超聲時間和提取溫度3個因素為自變量，以聚戊烯醇得率為響應值，設計3因素3水平的實驗。Box-Behnken試驗設計結果見表3。

圖4 超聲提取溫度對聚戊烯醇提取率的影響 (n=3)Fig.4 Effect of ultrasonic extraction temperature on yield of polyprenols(n=3)

2.2.1 回歸分析建模 采用Design-Expert程序對所得數據進行回歸分析，3個因子經過擬合得到的回歸方程為:Y=1.28-0.088X1+0.29X2-0.15X3-0.37X1X2+0.12X1X3+0.056X2X3-0.31X12+0.011X22-0.4X32模型的R2=0.916 9，這說明這種實驗方法是可靠的，使用該方程模擬真實的3因子3水平的分析是可行的［11-13］。

表3 Box-Behnken實驗設計Tab.3 Box-Behnken experiment design

2.2.2 方差分析 對回歸模型進行方差分析，試驗結果見表4:模型的F值8.58表示模型是顯著的，在這個模型中，X2、X3、X1X2、X12、X32對Y的影響是顯著的 (P＜0.05)，因此，各個試驗因素對響應值的影響不是簡單的線性關系。

2.2.3 響應面和等值線分析 為了考察各個因子間的交互作用，對試驗結果進行了3D響應面和等值線分析。發現料液比和超聲溫度的交互作用最大，對聚戊烯醇得率的影響極為顯著;超聲時間和超聲溫度的交互作用次之;超聲時間和料液比的交互作用較小。其中反應料液比和超聲溫度交互作用的響應面見圖5。

表4 二次回歸模型方差分析Tab.4 Analysis of variance of quadratic regression model

用design-expert軟件進行提取方案優化，得到最佳條件為:料液比1∶11.28、超聲時間60 min、回流萃取溫度37.28℃，理論最佳得率為1.772%。

圖5 響應面和等值線分析Fig.5 Analyses of Response surface and contour

2.3 最優工藝參數組合驗證

為了進一步驗證RSM的可靠性，綜合單因素和響應面優化實驗結果，考慮到實驗誤差，按上述最優工藝參數進行3次平行實驗，同時考慮到實際操作，以液料比1∶12，超聲溫度38℃、超聲時間60 min的條件，重復實驗3次，試驗結果，3組聚戊烯醇得率分別為1.653%，1.627%，1.481%，求得平均值為1.587%，與理論預測值比較誤差為0.185%，因此，響應面法對銀杏葉聚戊烯醇提取條件的優化是可行的，是具有實際應用價值［14，15］。

3 討論

3.1 影響銀杏雄株葉片聚戊烯醇提取的因子

影響銀杏雄株葉片聚戊烯醇提取的因子有葉片處理過程中的葉片粉碎的顆粒大小，有提取過程中的超聲波功率，時間，溫度，有提取溶液的種類，純度等，本研究首先對提取溶劑種類進行選擇，然后根據前人的研究經驗［8］，選擇了料液比、時間和溫度三個主要影響的因子，并設計響應面實驗對其進行優化，得到了在提取銀杏葉聚戊烯醇過程中這三個影響因子的最佳組合。而對于其他影響因子如粉碎顆粒大小、超聲波功率等還有待進一步研究。

3.2 銀杏雄株葉片聚戊烯醇最佳提取工藝的關鍵技術

響應面設計法可以從整體的角度上確定各個影響因素的最佳組合，以達到最優的響應值。該方法已廣泛應用于各種生物技術領域［11，13］。本實驗采用響應面設計法對提取過程中的各因素進行了優化，得出最佳提取條件:以正己烷作為提取劑，料液比1∶12、超聲時間60 min、回流萃取溫度38℃，在此工藝條件下，銀杏聚戊烯醇的得率為1.587%。

3.3 銀杏葉不同鏈長聚戊烯醇的相對含有量對測定結果的影響

以往的研究結果表明，銀杏葉中含有C60-C120聚戊烯醇，其中主要為 C85、C90、C95聚戊烯醇，約占82%［16］。而C85和C90就可以占到銀杏葉聚戊烯醇總量的60%左右，老樹葉甚至可以達到70%［17］。Bamba等也曾以其中一種聚戊烯醇為內標物，定量分析銀杏葉中C85、C90、C95這3種聚戊烯醇［18-19］，因此本實驗以C90作為外標物，定量分析C85、C90、C95這3種聚戊烯醇的量作為銀杏雄株葉片聚戊烯醇含量的指標。

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