乙型肝炎相關性肝衰竭不同黃疸證的腸道菌群分析

朱文芳，孫克偉，陳 斌，胡 莉，王 軒

（湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院傳染科，湖南 長沙 410007）

通過對乙型肝炎相關性肝衰竭不同黃疸證型腸道菌群的需氧菌、厭氧菌的定性定量研究，以及血漿內(nèi)毒素的研究，探討黃疸不同證型的腸道菌群變化可能存在的陰黃化機制，以及在其并發(fā)細菌感染中可能起到的作用。現(xiàn)將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象

2011年8月至2012年2月在湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院傳染科住院治療的乙型肝炎相關性肝衰竭患者，共30例。符合2006年中華醫(yī)學會感染病學分會肝衰竭與人工肝學組、中華醫(yī)學會肝病學分會重型肝病與人工肝學組制定《肝衰竭診療指南》中慢加急性（亞急性）肝衰竭的診斷標準［1］。排除標準：（1）急性肝衰竭、亞急性肝衰竭；（2）其他病因（包括其他病毒感染、自身免疫性、藥物性、酒精性、中毒性、Wilson病等代謝性疾病）導致的肝衰竭；（3）在慢性乙型肝炎或乙型肝炎肝硬化基礎上重疊感染甲型肝炎病毒（HAV）、戊型肝炎病毒（HEV）、丙型肝炎病毒（HCV）及丁型肝炎病毒（HDV）感染所致慢加急性（亞急性）肝衰竭者；（4）合并原發(fā)性膽汁性肝硬化（PBC）、原發(fā)性硬化性膽管炎（PSC）、結石、腫瘤等肝外梗阻性黃疸；（5）合并原發(fā)性肝癌或其他腫瘤患者；（6）妊娠或哺乳期婦女；（7）服用免疫抑制劑的患者。 按中醫(yī)“黃疸”辨證［2-3］：其中陽黃患者 15 例，證屬濕熱蘊結型；男 11 例，女 4 例；年齡（40±12.3）歲；而臨床無法按陰、陽黃辨證的一類患者，即非陽非陰黃（陰陽黃）患者15例，證屬脾虛兼濕熱型；男13例，女 2 例；年齡（42±11.2）歲。 健康組 10 例，來源于湖南中醫(yī)藥大學在校學生、教職工，男6例，女4例，年齡（38±13.1）歲。三組在年齡、性別方面比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 檢測方法

1.2.1 大便檢測 取晨起糞便標本收集于無菌杯，0.5 h內(nèi)接種；稱量第1支已含有9 mL的稀釋液的管G1，取黃豆大小標本放置于其中稱重G2。標本重G=G2-G1；振蕩器上充分震蕩，用1 mL槍吸1 mL于第2管，然后逐次進行倍比稀釋；取10-7和10-5各50μL，分別添加于腸球菌培養(yǎng)基(EC培養(yǎng)基 自制)、腸桿菌培養(yǎng)基(中國藍培養(yǎng)基 青島)、乳酸桿菌培養(yǎng)基(LBS培養(yǎng)基 青島)、雙歧桿菌培養(yǎng)基(BLb瓊脂培養(yǎng)基 青島)、擬桿菌培養(yǎng)基(KVB培養(yǎng)基 青島)平板。L棒涂勻，從低濃度向高濃度，依次涂勻。將厭氧菌(乳酸桿菌、雙歧桿菌、擬桿菌)置于厭氧箱中，并需氧菌（腸球菌、腸桿菌）一起置于37℃恒溫細菌培養(yǎng)箱。24 h后鑒定需氧菌，72 h后鑒定厭氧菌。菌種鑒定：厭氧菌三級鑒定法，采用API生物化學鑒定系統(tǒng)，將細菌鑒定到屬水平，檢測下限為每克濕便2×10 cfu，對數(shù)換算后即為表1。

1.2.2 內(nèi)毒素檢測 采用鱟試劑基質(zhì)顯色法檢測，顯色基質(zhì)鱟試劑盒由廈門鱟試劑實驗廠有限公司提供。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 3組間腸道菌群比較

陽黃組與健康組比較腸道菌群變化表現(xiàn)為腸球菌、腸桿菌的顯著增多(P＜0.05，P＜0.01)，雙歧桿菌、乳酸桿菌等厭氧菌有減少的趨勢。說明陽黃組的腸道細菌在數(shù)量上偏離了正常的生理組合，提示乙型肝炎相關性肝衰竭陽黃證存在菌群失調(diào)，菌群失調(diào)以需氧菌的增多為主。陰陽黃組與健康組比較腸道菌群發(fā)生的變化更為明顯：腸球菌進一步顯著增多(P＜0.01)，而腸桿菌與健康人比較稍有增加，但無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；雙歧桿菌明顯減少(P＜0.01)，乳酸桿菌亦減少（P＜0.05），類桿菌無明顯變化。說明陰陽黃/陰黃組的腸道細菌在數(shù)量上偏離了正常的生理組合，提示乙型肝炎相關性肝衰竭陰陽黃證存在菌群失調(diào)，菌群失調(diào)以雙歧桿菌、乳酸桿菌等厭氧菌的減少為主，伴有腸球菌的增多。陰陽黃組與陽黃組比較腸球菌顯著增多（P＜0.01），而腸桿菌的數(shù)量反而減少 （P＜0.05），雙歧桿菌進一步減少（P＜0.05），乳酸桿菌有下降的趨勢，但無統(tǒng)計學意義。見表1。

表1 健康組、陽黃組和陰陽黃組濕便中腸道菌群的比較 ，LgN，CFU/g）

表1 健康組、陽黃組和陰陽黃組濕便中腸道菌群的比較 ，LgN，CFU/g）

注：與健康組比 *P＜0.05，**P＜0.01；與陽黃組比 #P＜0.05，##P＜0.01。

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2.2 血漿內(nèi)毒素檢測結果

乙型肝炎相關性肝衰竭患者與健康人比較，血漿內(nèi)毒素水平均顯著升高(P＜0.05，P＜0.01)，并且陰陽黃組血漿內(nèi)毒素水平較陽黃組升高（P＜0.01）。見表2。

表2 健康組、陽黃組和陰陽黃組的血漿內(nèi)毒素比較 s，EU/mL）

表2 健康組、陽黃組和陰陽黃組的血漿內(nèi)毒素比較 s，EU/mL）

注：與健康組比較 #P＜0.05，##P＜0.01；與陽黃組比較 *P＜0.01。

組 別健康組陽黃組陰陽黃組n 10 15 15內(nèi)毒素0.031±0.012 0.048±0.018#0.141±0.051##*

3 討論

腸道微生態(tài)由三個部分組成：腸道菌群、腸上皮細胞、腸道黏膜免疫系統(tǒng)［4］。其中寄居在腸道中為數(shù)眾多的腸道菌群既具有對外來菌抗定植作用，也與腸黏膜的屏障和免疫功能有密切關系。近年來，由于對腸－肝軸認識的逐步深入，腸道菌群在慢性肝病發(fā)病過程中的作用備受關注［5］。研究報道，慢性肝病尤其是慢性重型肝炎患者存在嚴重腸道微生態(tài)改變，雙歧桿菌、類桿菌數(shù)量顯著減少，腸桿菌、酵母菌數(shù)量顯著增加。腸道菌群紊亂時，腸黏膜細胞之間緊密連接下降、通透性增高，使腸黏膜的屏障功能減弱，造成大量腸源性內(nèi)毒素易位進入門脈系統(tǒng)，同時慢性肝病時肝臟庫普弗細胞的代謝和清除內(nèi)毒素的能力下降，從而導致血漿內(nèi)毒素水平的增高，加重了肝臟的打擊。

本研究利用傳統(tǒng)大便培養(yǎng)方法，對5種腸道優(yōu)勢菌腸球菌、腸桿菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌、類桿菌進行培養(yǎng)研究。發(fā)現(xiàn)乙型肝炎相關性肝衰竭患者中醫(yī)辨證中不同的黃疸證患者的腸道菌群有不同的特點。與健康人相比較，以“濕熱”為主的陽黃證腸道菌群失調(diào)表現(xiàn)為腸球菌、腸桿菌的顯著增多 (P＜0.05，P＜0.01)，即以需氧菌的增多為主要表現(xiàn)，這一特點與近年來對脾胃濕熱證的腸道菌群研究結論相吻合。江月斐［6］等研究表明脾胃濕熱證組細菌密度及比例上明顯高于脾虛組，包括許多革蘭陽性菌與革蘭陰性菌的感染以及HP感染，這在一定程度上說明了脾胃濕熱證存在明顯的炎癥和感染。因此菌群失調(diào)以腸球菌、腸桿菌顯著增多的陽黃證患者正處于激烈的“正邪相爭”狀態(tài)［7］。以脾虛為主的陰陽黃證腸道菌群失調(diào)表現(xiàn)為腸球菌的進一步顯著增多(P＜0.01)，而腸桿菌與陽黃證比較反而減少 （P＜0.05）；雙歧桿菌、乳酸桿菌的減少。專性厭氧菌（益生菌）的減少提示此時期機體的免疫功能的急劇下降，腸道菌群嚴重失調(diào)。回顧陰陽黃患者的臨床用藥情況，有著長期抗生素的用藥史，經(jīng)驗告訴我們肝病患者主要以G-桿菌的過度生長引起感染，因此，臨床上常首選對革蘭氏陰性菌敏感的第三代頭孢菌素進行預防或治療，因而導致了本研究腸桿菌反而減少，使得原本致病力很低的腸球菌感染增多，甚至合并真菌的感染。這一結論與王曉東［8-9］等發(fā)現(xiàn)腸球菌是重型肝炎患者感染的重要條件致病菌的臨床結論相符。因此對于陰陽黃患者，臨床中我們更應關注由于腸道菌群失調(diào)導致的細菌移位而引起的繼發(fā)感染、二重感染。

從中醫(yī)學五臟學說來講，小腸和大腸的功能是“脾主運化”、“胃主受納”中的一部分，腸泌別清濁和傳化糟粕的作用是脾氣升清、胃氣降濁作用的進一步延伸。脾胃虛弱或功能受損，即可引起腸道泌別清濁和傳化糟粕功能的異常，進而引起腸道功能障礙。因此腸道菌群失調(diào)、腸道屏障功能障礙，就臟腑而言主要涉及脾胃，是脾虛證的病理生理表現(xiàn)。乙型肝炎相關性肝衰竭患者由于肝臟功能下降、胃排空延遲、腸道長期瘀血等諸多病理改變，臨床上除黃疸不退外，最常見的臨床表現(xiàn)為乏力、納差、食后腹脹加重、大便溏等脾虛證候，且脾虛證候貫穿之始終。隨著脾虛癥狀的加重，“陽黃-陰陽黃-陰黃”過程中，雙歧桿菌亦逐步顯著減少，腸道菌群失調(diào)的程度也愈來愈明顯，血漿內(nèi)毒素水平逐步增高，進一步說明了“脾虛”是陰黃化機制的病理生理基礎。

鑒于客觀條件限制，本研究納入病例數(shù)不多，樣本量小。典型陰黃證的病例收集過少，脾腎陽虛狀態(tài)之陰黃證與腸道菌群、內(nèi)毒素的之間關系，有待進一步深入研究。由于臨床治療的需要，雖本實驗結果并不能代表乙型肝炎相關性肝衰竭患者腸道菌群的自然演變過程，但鑒于此類病人在臨床治療時抗生素應用的重要性及廣泛性，故仍具有一定的臨床指導意義。

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