泰樂菌素降解菌的篩選及其降解動力學研究

孫瑞珠 ,馬玉龍 ,2*,張 娟 ,張作義 ,王 艷 ,王 敏 ,馬志強 (.寧夏大學化學化工學院,寧夏 銀川75002；2.寧夏天然藥物工程技術研究中心,寧夏 銀川 75002；.銀川市西夏區(qū)農(nóng)牧水務局,寧夏 銀川 75002)

泰樂菌素(Tylosin)是一種由弗氏鏈霉菌(Streptomyces fradiae)產(chǎn)生的大環(huán)內(nèi)酯類獸用抗生素,被廣泛用于畜禽生產(chǎn)及治療[1].抗生素類藥物進入動物體內(nèi)后,約 30%～90%以藥物原形或代謝產(chǎn)物的形式隨畜禽糞便排出體外[2-4].近年來,由于抗生素在畜牧養(yǎng)殖中的大量使用,導致其對環(huán)境污染的問題日趨嚴重,如何解決此類問題,已成為當前國際上的討論熱點之一[5].研究表明,土壤中抗生素殘留按濃度計算已經(jīng)達到 11～300μg/kg,這個數(shù)字已接近于土壤中其他農(nóng)藥類有機污染物的含量水平[6-8].微生物發(fā)酵法生產(chǎn)抗生素過程中,發(fā)酵醪液進行固液分離時會產(chǎn)生大量廢棄藥渣,這些含有高營養(yǎng)成分的藥渣若能有效利用,不僅可以緩解資源危機,還可達到廢物治理的目的,然而,由于殘留有未分離完抗生素的存在,極大地限制了抗生素藥渣的循環(huán)利用.

近年來,國內(nèi)外在廢水、畜禽糞便中殘留抗生素去除的研究報道較多,而關于藥渣中殘留抗生素處理的報道甚少. 姚斌等[9]研究表明,混合光合細菌PSB-DR對2,3,4-三氯苯酚的降解符合高濃度底物抑制的酶促反應類型.Kummerer等[10]、Ingerslev 等[11]和 Drillia 等[12]通過生物法,對生活廢水中殘留的環(huán)丙沙星、氧氟沙星、甲硝噠唑、復方新諾明、土霉素等進行降解研究,但所得結(jié)果并不一致.甘露等[13]采用紫外輻射光解與生物降解同步耦合的氣升式內(nèi)循環(huán)反應器降解喹啉,其降解動力學結(jié)果可用有抑制性的Haldane模型描述.Yang等[14]報道,在厭氧條件下土壤中微生物對磺胺嘧啶類抗生素所起的降解作用很小.而研究表明,堆肥能有效去除畜禽糞便中殘留的四環(huán)素類抗生素[15-19].童子林等[20]提出豬糞在中溫(35℃)厭氧消化中,四環(huán)素和金霉素的降解過程符合一級反應動力學方程.

目前,抗生素類污染物處理方法的研究主要集中于膜分離、好氧厭氧反應器等工藝方面.生物修復是一種去除環(huán)境污染物經(jīng)濟有效的治理技術[21-23],而對降解抗生素類污染物的高效降解菌株的篩選及其降解動力學的研究報道較少.因此,本研究從降解動力學角度,探討生物降解藥渣中殘留泰樂菌素的機理,以期為泰樂菌素廢棄藥渣環(huán)保處理提供科學依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試樣品 泰樂菌素標樣購于美國Sigma公司,泰樂菌素藥渣(泰樂菌素發(fā)酵醪液進行固液分離時產(chǎn)生的菌餅部分,其主要成分是微生物菌絲體、未代謝利用完的有機物、無機鹽,其干物質(zhì)殘留的泰樂菌素含量為 2.14mg/g)由泰樂菌素生產(chǎn)企業(yè)提供.

1.1.2 培養(yǎng)基 酵母膏蛋白胨葡萄糖(YPD)培養(yǎng)基:酵母膏1g,蛋白胨2g,葡萄糖2g,水100mL(固體加入瓊脂 1.2g).藥渣培養(yǎng)基:泰樂菌素藥渣與水按 1:10比例(重量百分比)混合后,置室溫下浸泡 12～14h,離心棄沉淀,再通過抽濾棄除漂浮的雜質(zhì)即可.將泰樂菌素含量分別調(diào)為 50,100,200,300,400,500mg/L.藥渣蛋白胨培養(yǎng)基:在上述100mL藥渣培養(yǎng)基中加入蛋白胨0.5g.

1.1.3 菌株TS1分離源、篩選與馴化分離 菌株 TS1分離源采于長期堆放泰樂菌素藥渣附近的土壤. 稱取10g土樣,加入裝有90mL pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液的250mL三角瓶中,并加入一定量的玻璃珠,在搖床上充分打散土樣后,取土壤浸出液備用.向土壤懸液中加入泰樂菌素藥渣及適量的蛋白胨、葡萄糖. 經(jīng)過逐次投加的方式,泰樂菌素濃度從 50mg/L依次增加到 500mg/L,置于35℃、130r/min的恒溫振蕩搖床中培養(yǎng)7d.每個馴化培養(yǎng)周期結(jié)束后,取培養(yǎng)液 10mL接入到90mL新鮮培養(yǎng)基中,開始下個周期培養(yǎng),經(jīng)過 6個周期馴化培養(yǎng).將所篩選出的復合菌在含有泰樂菌素的平板上,根據(jù)菌落生長快慢、大小、形狀、顏色等進行多次劃線分離純化,得到 3株不同形態(tài)的單一菌株.用無菌接種環(huán)分別挑取分離的單一菌落1環(huán)于1.1.2所示的YPD液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng),分別取10 mL處于對數(shù)生長期的菌液(約 48h 達到對數(shù)增長期,此時的菌體濃度為108cells/mL),接入到90mL泰樂菌素初始濃度為500mg/L的藥渣蛋白胨培養(yǎng)液中,考察 3種菌株對泰樂菌素的降解效果.通過降解效果的對比,篩選出降解能力較強的優(yōu)勢菌株.進行純化后挑取單一菌落接種于斜面培養(yǎng)基,4℃冰箱保存.以上操作均在無菌環(huán)境下進行.

1.2 試驗方法

1.2.1 泰樂菌素降解試驗 配制泰樂菌素濃度分別為50, 100, 200, 300, 400, 500mg/L的藥渣蛋白胨培養(yǎng)液,初始 pH 值調(diào)至 7.0～7.2,各取 90mL于250mL三角瓶中,分別接入10mL處于對數(shù)增長期的菌液(所用培養(yǎng)基為1.1.2所示的YPD培養(yǎng)基);置于恒溫振蕩搖床中,在 35℃、130r/min下培養(yǎng),間隔12h定期取樣測定泰樂菌素濃度,研究不同初始濃度條件下泰樂菌素的降解效果.每個處理設置3個平行.

1.2.2 共代謝基質(zhì)降解試驗 配制泰樂菌素濃度為300mg/L的藥渣培養(yǎng)基,取90mL于250mL三角瓶中,分別加入葡萄糖、蛋白胨和氨氮各0.5g.再接入 10mL處于對數(shù)增長期的菌液,置于35℃、130r/min恒溫振蕩搖床中培養(yǎng),間隔 12h定期取樣測定泰樂菌素濃度,探討菌株在加入蛋白胨、葡萄糖和氨氮作為共代謝基質(zhì)時對泰樂菌素的降解特性(同時以不外加其他基質(zhì)為對照),每個處理設置3個平行.

1.3 檢測方法

1.3.1 微生物濃度測定方法 定期取2mL培養(yǎng)液,用UV-1200型紫外分光光度計測定500nm處的光密度(OD500),細菌濃度的計算公式為:Ccell=314.5× OD500[24].

1.3.2 泰樂菌素測定方法 降解前后藥渣中殘留泰樂菌素濃度采用高效液相色譜儀(LC-20AT,日本島津),用外標法定量檢測.樣品前處理為:取5mL樣品,用三氯乙酸終止反應[25].然后用10mL乙腈超聲提取10min,5000r/min離心10min,共提取3次,收集上清液于45℃下減壓旋轉(zhuǎn)蒸干.再加入 10 mL醋酸鈉緩沖溶液(pH5.5)和 5mL正己烷,5000r/min離心10min,水相以1m/min流速,過預先用5mL甲醇、5mL水活化處理后的C18固相萃取柱,然后用5mL水和5mL甲醇-水(體積比為2: 8)洗滌C18柱.分析物用5 mL甲醇洗脫并收集全部洗脫液,用10 mL體積比為30:70的乙腈-磷酸鹽緩沖溶液溶解[26-27],待溶解完全后把溶液過0.45μm濾膜后保存,供高效液相色譜測定.

色譜條件:色譜柱為 Agilent HC-C18柱(5μm,250 mm×4.6mm);流動相:乙腈:KH2PO4(0.02mol/L,pH2.5) = 30:70(體積比)等度洗脫;流速:1mL/min;柱溫:25 ℃;進樣量:20μL;檢測波長:285nm.

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株TS1菌落形態(tài)

經(jīng)過平板初篩后獲得 3株菌,再經(jīng)過復篩后保留了 1株對泰樂菌素降解效果最大的菌,其對初始濃度為100mg/L的泰樂菌素在5d內(nèi)的降解率可達100%,將其命名為TS1.菌株TS1在YPD固體培養(yǎng)基上呈圓形,中間凸起,乳白色,表面光滑,不透明,邊緣整齊,菌落直徑約為2～3mm(圖1).菌株TS1經(jīng)革蘭氏染色確定為革蘭氏陰性菌,顯微鏡觀察是桿狀菌(圖2).

圖1 菌株TS1在YPD固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of strain TS1 on solid YPD medium

圖2 菌株TS1經(jīng)革蘭氏染色后細胞形態(tài)(×1000)Fig.2 Cell morphology of strain TS1 after Gram staining(×1000)

2.2 菌株TS1對不同初始濃度泰樂菌素的降解效果及降解動力學

2.2.1 不同初始濃度泰樂菌素的降解效果 由圖 3可知,當泰樂菌素初始濃度為 50,100mg/L時,5d內(nèi)菌株TS1的降解率可達100%;當泰樂菌素初始濃度為200mg/L時,處理6d可降解99%;而當泰樂菌素初始濃度為300～500mg/L時,7d內(nèi)則可降解99%以上.圖4是初始濃度為300mg/L的泰樂菌素降解前后的液相色譜圖.雖然在所試泰樂菌素初始濃度范圍內(nèi),菌株TS1對泰樂菌素的降解率不同,但菌株對泰樂菌素的絕對降解量隨其初始濃度的增加而增大.同時,降解效率和菌株生長具有一定的一致性,開始時(0～1d)菌株生長處于延遲期,降解效率低;隨著菌株進入對數(shù)生長期(2～3d),降解效率顯著增高;之后隨著時間的延長,由于營養(yǎng)成分的缺失和代謝廢物的增加,菌株生長逐漸到衰退期,對泰樂菌素的降解能力也隨之下降,降解曲線趨于平緩.

2.2.2 降解動力學分析 將不同初始濃度下的降解數(shù)據(jù)按一級反應動力學方程進行線性擬合,即:lnc=-kt+A,式中k[mg/(L·d)]表示降解速率常數(shù),t(d)是降解時間,c(mg/L)是降解t時殘留的泰樂菌素濃度,A為常數(shù).擬合結(jié)果顯示出良好的線性關系(圖5).

由表 1可見,菌株對泰樂菌素的降解符合一級動力學特征,相關系數(shù)R2均高于0.95,所得一級動力學方程均能較好地反映菌株 TS1對泰樂菌素降解的趨勢.泰樂菌素濃度在100～ 400mg/L時,降解速率常數(shù)k均大于0.4,半衰期都小于2d;當泰樂菌素濃度增加到500mg/L時,降解速率常數(shù)k明顯下降,半衰期也延長到2.03d.說明高濃度的泰樂菌素對菌株的降解有抑制作用.

圖4 初始濃度為300mg/L的泰樂菌素藥渣經(jīng)菌株TS1處理前后的HPLC圖譜Fig.4 HPLC spectra of tylosin in pharmaceutical waste with initial concentration of 300 mg/L before (a) and after (b) treatment with strain TS1 for 7d

2.3 不同共代謝基質(zhì)中菌株對泰樂菌素的降解效果

由圖 6可見,蛋白胨或氨氮分別做泰樂菌素降解的共代謝基質(zhì)時,菌株在7d內(nèi)對初始濃度為300mg/L的泰樂菌素降解率可達 99%以上;而用葡萄糖作為共代謝基質(zhì)時,菌株在 10d內(nèi)對其降解率只有 66.7%;而在不外加其他物質(zhì)的泰樂菌素藥渣體系中,9d內(nèi)泰樂菌素降解率可達 99%以上.由降解效率可知,蛋白胨的加入為菌株提供了優(yōu)質(zhì)氮源,前3d對泰樂菌素的降解率已達56.7%;氨氮體系中,菌株在第1d對泰樂菌素未顯降解作用,第2d才開始降解,可能是菌株在適應了環(huán)境后才開始利用氨氮,但其降解速率仍然低于添加蛋白胨的體系;而體系中加入葡萄糖后,菌株對泰樂菌素的降解程度最小,在 10d內(nèi)的降解率低于菌株 TS1在泰樂菌素藥渣中的降解率,說明葡萄糖的加入不利于菌株TS1對泰樂菌素的降解作用.

圖5 一級反應動力學線性擬合Fig.5 First-order kinetic relationship between ln c vs.time

表1 不同泰樂菌素初始濃度下降解動力學結(jié)果Table 1 Degradation kinetic of tylosin at differently initial concentrations

由表 2可知,共代謝體系中菌株對泰樂菌素的降解反應速率常數(shù)K蛋白胨+泰樂菌素藥渣＞K氨氮+泰樂菌素藥渣＞K葡萄糖+泰樂菌素藥渣,這與其降解率數(shù)據(jù)結(jié)果相一致.蛋白胨或氨氮的加入均有助于菌株對泰樂菌素的降解,其速率常數(shù)分別為 0.4174和 0.3719mg/(L·d),均大于泰樂菌素藥渣體系中的速率常數(shù)0.3301mg/(L·d),而加入葡萄糖后,反應速率常數(shù)為0.1076mg/(L·d),t1/2延長至 6.41d,提示葡萄糖的加入不利于菌株 TS1對泰樂菌素的降解作用.因為葡萄糖是微生物較容易利用的碳源,體系中加入葡萄糖時,菌株優(yōu)先利用葡萄糖,導致菌株 TS1對泰樂菌素的降解速率下降,半衰期延長.因此,在菌株 TS1降解泰樂菌素的實際應用中,可加入一定量氨氮,以促進降解菌對泰樂菌素的降解作用.

圖6 不同降解體系中泰樂菌素濃度隨反應時間的變化Fig.6 Changes of tylosin concentrations with time in various biodegradation systems

表2 不同降解體系中反應動力學Table 2 Kinetic in different biodegradation systems

3 結(jié)論

3.1 從長期堆放泰樂菌素藥渣的土壤中篩選分離出1株泰樂菌素高效降解菌株 TS1.用該菌處理泰樂菌素藥渣,5d內(nèi)能完全降解初始濃度分為50和100mg/L的泰樂菌素;6d內(nèi)對200mg/L泰樂菌素的降解率達 99%以上,7d內(nèi)對 300～500mg/L泰樂菌素的降解率均達99%以上.

3.2 菌株TS1對不同初始濃度泰樂菌素的降解符合一級動力學特征.在所研究濃度范圍內(nèi),泰樂菌素濃度在100～400mg/L時,降解速率常數(shù)k均大于0.4,半衰期小于2d;當濃度達到一定限度時,反應速率開始顯著下降,高濃度泰樂菌素抑制菌株對其的降解.

3.3 在降解體系中,蛋白胨或氨氮的加入促進了菌株對泰樂菌素的降解作用,而葡萄糖則對菌株降解泰樂菌素有抑制作用.

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