一株高效降解菲的植物內生細菌篩選及其生長特性

劉 爽,劉 娟,凌婉婷,朱雪竹,高彥征 (南京農業大學,土壤有機污染控制與修復研究所,江蘇 南京 210095)

多環芳烴(PAHs)是由2個或2個以上苯環組成的土壤環境中常見的一類重要持久性有機污染物,其疏水性強、難于降解[1].作為疏水性有機污染物,土壤中 PAHs可被植物吸收并在體內積累[2].如何降低植物 PAHs污染的風險是當前農業環境領域研究的熱點之一.

植物內生細菌是指能夠定殖在植物健康組織間隙或細胞內、并與宿主植物建立和諧共生關系的一類微生物[3],可促進植物生長,增強宿主植物抗逆性、抗病蟲害等作用,并可作為生防菌和外源基因的重要載體[4-5].研究表明,植物內生菌可影響植物吸收重金屬.Sun等[6]從銅礦區油菜體內篩選出內生細菌JL35、YM22、YM23,浸染后蕓苔地上部銅含量提高了 63%～125%.Sheng等[7]分離了 2株植物內生細菌,可提高植株對鉛的吸收.然而遺憾的是,關于植物內生菌影響植物吸收有機污染物的報道仍很少.Ho等[8]指出內生細菌Achromobacter xylosoxidansF3B可以提高多環芳烴污染土壤上植株的根長和生物量,增強植株對PAHs的耐受性.Barac等[9]將利用基因改造過的內生細菌B.cepaciaL.S.2.4浸染黃色羽扇豆,發現通過植物葉片揮發的甲苯量減少 50%～70%.有學者推測篩選具有降解特性的植物功能內生菌、并將其定殖在目標植物上,有望提高植物對有機污染物的降解作用[10-11].然而,針對PAHs等持久性有機污染物,能否利用內生細菌來降解植物體內污染物,進而減低作物污染的風險,國內外仍少有資料報道.

本研究從長期受PAHs污染的植物看麥娘中,篩選出一株高效降解菲的菌株 Pn2,研究了不同條件下菌株Pn2生長特性及其對菲的降解作用.研究結果一方面可豐富植物內生細菌菌種庫,另一方面也可為進一步研究植物PAHs污染的內生細菌調控技術、減低植物污染風險、保障農產品安全等提供依據.

1 材料與方法

1.1 材料

無機鹽培養基(MSM):NaCl 1.00g/L,NH4NO31.00g/L, K2HPO41.50g/L, KH2PO40.50g/L, MgSO4·7H2O 0.10g/L, FeSO40.025g/L,蒸餾水 1000mL,pH 7.0.菲降解菌篩選培養基:MSM中加入一定量的菲丙酮溶液(丙酮＜1‰),配制到所需濃度.1/10LB培養基:酵母膏0.50g/L,蛋白胨1.00g/L,NaCl 1.00g/L ,蒸餾水1000mL.固體培養基加 1.5%的瓊脂.上述培養基于 121℃下蒸汽滅菌20min.

菲(PHE,純度＞98%)購自 Aldrich Chemical Co.甲醇為色譜醇,其他試劑為分析純.

1.2 實驗方法

1.2.1 植物內生細菌分離 將采自南京江寧揚子石化芳烴廠排污口的新鮮看麥娘植株表面消毒: 植物用自來水沖洗干凈后,超凈臺內用75%酒精漂洗 3～5min,無菌水沖洗 3～4次,0.1%HgCl2溶液漂洗2～5min,無菌水再沖洗數次.將經表面消毒的植物樣品移入LB固體平板上、28℃培養 24h后,檢查平板上是否有細菌生長.將經檢驗消毒完全的植株移入無菌研缽,用滅菌剪刀剪碎后,加無菌水充分研磨,取上清液梯度稀釋涂布于100mg/L菲降解固體培養基平板上,28℃培養 3d、待菌落長出,利用平板劃線分離純化出菌株.

1.2.2 具有菲降解特性的植物內生細菌篩選 挑取單菌落劃線于1000mg/L菲降解菌篩選固體培養基上,28℃培養 3d,觀察菌株能否生長.挑選能在菲篩選固體培養基上生長良好的菌株進行菲降解實驗.

1.2.3 菌懸液制備 單個菌落接種于1/10LB培養基中,于搖床 30℃和 150r/min下振蕩培養18h,10000r/min離心 3min,棄盡上清液,用 MSM培養基清洗菌體2次后,MSM培養基重新懸浮菌體細胞,調整菌體濃度到OD600=1.

1.2.4 液體培養條件下菌株 Pn2對菲的降解向無菌三角瓶中加入一定量的菲丙酮溶液,待丙酮完全揮發后加入20mL MSM培養基,測得反應瓶中菲的濃度為49.92mg/L,以5%的接種量加入菌懸液,于搖床上 30℃和 150r/min下振蕩培養,每隔6h整瓶取樣,3個重復.測定培養液中菲濃度和細菌數量.

1.2.5 污染強度對 Pn2降解性能的影響 向MSM 培養基中加入菲丙酮溶液,瓶中菲濃度分別為 50,100,150,200,250mg/L,以 5%的接種量加入菌懸液,30℃和150r/min下振蕩培養,每隔24h整瓶取樣,測定培養液中菲濃度.

1.2.6 接種量對Pn2降解性能的影響 向MSM培養基中加入菲丙酮溶液,瓶中菲濃度為50mg/L,分別以5%、10%、15%的接種量加入菌懸液,30℃和150r/min下振蕩培養,每隔12h整瓶取樣,測定培養液菲濃度.

1.2.7 菌株鑒定 利用菌體形態觀察、生理生化試驗并結合16Sr DNA序列同源性分析對菌株Pn2進行鑒定,確定其分類地位.菌株生理生化特性測定參照文獻[12].采用細菌DNA提取試劑盒提取菌株Pn2的DNA,并利用PCR擴增其16S rDNA,擴增產物送于南京金思瑞科技有限公司測序,所獲測序結果在 NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中與相關的16S rDNA序列進行同源性比對分析.

1.2.8 菌株Pn2生長特性 研究了溫度、pH值、鹽濃度、通氣量對Pn2生長的影響.以5%接種量向1/10LB液體培養基中加入菌懸液,分別在不同溫度的搖床上 150r/min下振蕩培養 18h,測定菌液OD600值.以5%接種量分別接種菌株Pn2于不同 pH值、不同鹽濃度、不同裝液量的 1/10LB液體培養基中,30℃和 150r/min下振蕩培養 18h后測定菌液OD600值.研究了菌株Pn2的抗性.將菌株點接于不同濃度的抗生素平板,于30℃恒溫下培養24h,觀察其生長情況.

1.3 分析方法

1.3.1 培養液中菲濃度測定 整瓶取樣,加入等體積的甲醇,超聲 30min,使瓶中菲全部溶解,過0.22μm 的濾膜,用高效液相色譜儀(HPLC)測定.HPLC檢測儀器及條件:島津 LC-20AT高效液相色譜儀(檢測器型號 SPD-20A),色譜柱為4.6×150mm 烷基 C18反相柱,柱溫 40℃,流動相為甲醇:水(9:1)、流速為0.9mL/min,檢測波長為245 nm,進樣量 10μL.此方法菲的回收率為 101.69%,相對標準偏差RSD為5.65%(n=6).

1.3.2 OD值測定 使用 UVmini-1240紫外分光光度計測定菌液的OD值,檢測波長為600nm.

1.3.3 細菌數量測定 采用平板稀釋涂布法測定培養液中細菌數量,平板為菲降解菌篩選固體平板.

2 結果與分析

2.1 降解作用

菌株 Pn2對菲的降解動力學曲線如圖 1(a)所示.接種后 72h內,菌株 Pn2可將菲從49.92mg/L降解到0.61mg/L,降解率為98.78%.接種后的前 12h,菌株處于環境適應期,菲降解率只有 8.05%.接種 12h后,進入菲快速降解階段.42h后,菲降解率＞90%,且基本保持不變,這說明菲已基本被降解.

菌株Pn2在接種后的12h內處于生長遲緩期,12h以后菌株 Pn2能利用唯一碳源菲快速生長,在30h后,由于菲碳源的減少,菌株Pn2生長速度減慢.72h內,細菌數量由1.88×108CFU/mL上升到 8.87×108CFU/mL.

接種12h后,培養液顏色發生了變化,由無色漸變成橙黃色.陶雪琴等[13]也發現此現象,這一現象應該是由于中間代謝產物引起的,需要進一步做代謝途徑以確認橙黃色物質.

對菲濃度隨時間的變化進行擬合,建立了Monod模型[14],推導后得到動力學方程式:

式中:c為菲濃度,mg/L;t為反應時間;K為動力學常數.菲的降解反應顯著地符合一級動力學特征,擬合結果見圖1(b).

圖1 菌株Pn2對菲的降解動力學曲線Fig.1 Degradation kinetic curve of phenanthrene by strain Pn2

接種12～24h內,接種量顯著影響了菲降解率,如圖2所示.接種12h時,接種量為10%和15%處理的菲降解率分別為38.01%和32.84%,而5%的接種量處理的菲降解率僅13%;表明,高接種量顯著提高了菲降解率;24h時,菌株接種量對菲降解率仍有顯著影響,且表現為接種量越大、菲降解率越高.36h和48h時,3種不同接種量對菲降解率的影響無顯著性差異,這主要是因為碳源菲不足,菌株Pn2沒有足夠的碳源利用.

圖2 接種量對菌株Pn2降解菲的影響Fig.2 Effect of inoculation amounts of Pn2 on phenanthrene degradation

污染強度對菌株 Pn2降解菲的影響見圖 3.接種 1d后,隨污染強度升高,菲降解率先增大后減小.這主要是由于 PAHs濃度低時不能快速誘導產生裂解酶[15],濃度太高則對微生物有毒副作用,限制PAHs的微生物降解.從資料來看,給定細菌濃度下,化合物存在一個能夠被有效降解的最適濃度[16].當菲污染強度為150mg/L時,菲降解率最大,說明供試條件下菲的最有效降解最適濃度為150mg/L.

對于污染強度50mg/L和100mg/L的處理,接種2d后,菲基本被菌株降解;說明菌株能快速降解低濃度菲.而對于污染強度為 150、200、250mg/L處理, 4d內,均表現為污染強度越高、菲降解率越小,說明高濃度菲對菌株Pn2降解有抑制作用;5～7d,污染強度對菲降解率的影響不顯著,從圖 3中可知,這是由于菲已經被降解90%以上,菌株沒有足夠碳源菲可供利用.7d時,污染強度為250mg/L的處理,菌株Pn2對菲的降解率可達 97.01%,說明菌株 Pn2能有效地降解高濃度菲.

2.2 菌株Pn2的鑒定

菌株 Pn2的生理生化實驗結果見表 1.所篩選出的菌株Pn2為革蘭氏染色陰性,不產芽孢,菌體形狀為桿狀,分散排列、好氧,在1/10LB培養基上 28℃下培養 3d形成的菌落呈圓形,較大,中凹隆起,濕潤光滑,有光澤,淡黃色.液體培養有絮狀沉淀,成膜能力較強.將菌株的16S rDNA序列在 NCBI上比對分析,與Naxibactersp.有很高的同源性(100%),再結合生理生化特性的結果,可初步鑒定菌株Pn2屬于納西桿菌屬.

表1 菌株Pn2的生理生化特征Table11 Physiological characteristics of Pn2 strain

2.3 菌株Pn2生長特性

pH值、溫度、鹽濃度和通氣量對菌株Pn2生長的影響見圖5.25～37℃下菌株Pn2能夠良好生長,最適生長溫度為 30℃.pH6～8范圍內 Pn2可良好生長,最適生長pH值為6.鹽濃度1%～2%范圍 Pn2生長良好,最適生長鹽濃度為 2%.裝液量在50～150mL范圍內,菌株Pn2能良好生長,且裝液量越少、通氣量越大,菌株生長越旺盛;表明菌株Pn2為好氧生長.

菌株Pn2抗生素抗性實驗結果見表2. Pn2僅對低濃度的氨芐青霉素和氯霉素有抗性,對其余幾種抗生素無抗性.該結果為菌株抗生素標記提供基礎依據.

圖3 污染強度對菌株Pn2降解菲的影響Fig.3 Effect of phenanthrene pollution stress on its degradation by strain Pn2

圖4 Pn2的系統進化發育樹Fig.4 The phylogenetic position of strain Pn2

圖5 環境條件對菌株生長的影響Fig.5 Effect of environmental conditions on the growth of strain Pn2

表2 菌株Pn2對抗生素的抗性Table 2 The antibiotic tolerance of strain Pn2

3 討論

以往文獻大量報道了植物對PAHs的吸收作用,但如何調控植物吸收積累行為、以有效地規避植物污染的風險,國內外相關報道很少.近年來研究發現,表面活性劑等可影響植物吸收 POPs.高彥征等[17]研究得出,低濃度非離子表面活性劑Tween80可促進植物吸收PAHs,而高濃度則起抑制作用.李瀅等[18]研究發現,Tween80濃度在CMC以上時可使小麥根中菲、芘和苯并[a]芘含量下降,卻提高了小麥莖葉中菲和芘的含量.張明等[19]發現,水培體系中生物表面活性劑鼠李糖脂在低濃度時能促進黑麥草根系吸收 PAHs.呂黎等[20]研究得出,陽離子表面活性劑能使白菜、茼蒿、胡蘿卜等蔬菜體內的菲、芘含量顯著減少,且土壤黏粒含量、作物脂肪含量越高,阻控效果越顯著.也有報道揭示溶解性有機質(DOM)可影響植物吸收 POPs[21].近來,有研究表明,接種叢枝菌根真菌可調控植物對PAHs等POPs的吸收作用.施啟文等[22]研究發現,添加菌劑可有效地促進莖葉中低環芳烴的降解.程兆霞等[23]研究發現,接種叢枝菌根真菌Glomus mosseae和Glomus etunicatum可促進三葉草和辣椒對土壤中芘的吸收,并顯著提高三葉草根的芘含量、根系富集系數、根和莖葉的芘積累量.然而能否利用植物內生細菌來調控植物對有機污染物的吸收作用,尚未有相關報道.本實驗篩選具有 PAHs降解能力的植物內生細菌、并試圖將其定殖于植物中,有望調控植物吸收PAHs.

PAHs降解菌的環境功能及應用已引起學者廣泛關注,但大部分功能降解菌篩選自污染土壤.周樂等[24]從土壤中篩選了一株高效降解菲的芽孢桿菌,50mg/L條件下,28℃培養27h,其對菲的降解率達 98.12%.毛健等[25]從污染區土壤中篩選了一株PAH降解菌,該菌經5d培養后可降解89.7%的苯并[a]芘.專性功能降解菌的降解效率高,但這些從土壤中分離的功能菌能否在植物體內定殖、并發揮降解效能,尚無文獻證實.最近有研究者提出,從污染區植物中篩選能降解PAHs的植物內生細菌,有望避免微生物生長條件的影響,更佳地在植物體內定殖[26-27];但是相關研究還很少.本實驗中,從PAHs污染區植物看麥娘中篩選出了一株高效降解菲的細菌菌株Pn2,經初步鑒定,Pn2屬于納西桿菌屬,以菲為唯一碳源(49.92mg/L)、振蕩培養3d, Pn2對菲的降解率達98.78%.該菌降解能力高于目前其他已報道的PAHs降解細菌的降解性能,且該菌屬未曾報道過.

有關細菌降解PAHs的途徑國內外已有大量報道.一般來說,細菌先將菲降解為中間物質 1-羥基-2萘酸,后者進一步的降解過程則因細菌不同而有差異,一般有鄰苯二甲酸鹽和萘代謝等兩種可能途徑[28].如假單胞菌屬(Pseudomonas)降解1- 羥基-2萘酸是通過萘代謝途徑進行的,而氣單胞菌屬(Aeromonas)、產堿桿菌屬(Alcaligens)、芽孢桿菌(Bacillussp.)則是通過鄰苯二甲酸鹽途徑降解 1-羥基-2萘酸[28].本實驗中納西桿菌屬降解菲的途徑尚未見報道,仍有待探索.

有關植物內生細菌在植物體內的定殖分布已有報道.劉云霞等[29]指出,植物內生細菌可定殖于植物的根毛、葉片、維管組織、木質部的表皮細胞、薄壁細胞、液泡等的間隙、細胞壁、細胞質中.最近,也有研究報道了 PAHs在植物體內的微觀分布;如陳冬升等[30]研究發現,黑麥草根亞細胞組分中菲的含量大小為細胞器＞根＞細胞壁.然而,本研究篩選所獲得的高效降解菌 Pn2能否在植物體內良好定殖、定殖后的分布及其與植物體內PAHs分布的關系等問題,仍有待深入探討.

4 結論

4.1 從 PAHs污染區植物看麥娘體內分離出一株可以菲為唯一碳源生長、并高效降解菲的植物內生細菌Pn2.經生理生化特征分析和16S rDNA序列同源性分析,初步鑒定該菌株為Naxibactersp., 該菌屬未曾見報道過.

4.2 篩選所獲得的菌株Pn2對菲有良好的降解性能.Pn2能以菲為唯一碳源生長,菲濃度為49.92mg/L時,供試條件下菲降解率高達98.78%.菌種接種量越大,菲降解率越高;隨污染強度升高,菲降解率先增大后減小,最適污染強度為150 mg/L.

4.3 菌株 Pn2有較強的環境適應能力.溫度為25～37℃、環境pH值為6.0～8.0、鹽濃度1%～2%范圍內,菌株Pn2生長狀況良好.菌株Pn2為好氧生長,通氣量越大,菌株生長越旺盛.菌株Pn2對低濃度的青霉素和氯霉素有抗性.

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