污泥厭氧消化和后續處理中沙門氏菌殺滅及VBNC發生

符 波,王 燕,姜 謙,陳 燕,劉 和 (江南大學環境與土木工程學院,環境生物技術研究室,江蘇 無錫214122)

隨著城市污水處理廠的不斷增多,污泥的產量也在不斷增加,污泥的土地利用處理已成為污泥資源化利用的發展方向.污泥中包含多種重金屬、有機污染物和病原微生物,尤其是未經妥善處理的污泥中病原微生物的種類和數量繁多[1].當這些含有病原微生物的污泥施入土壤后,對人類健康和生態環境都會帶來潛在風險和危害.污泥厭氧消化工藝是目前研究較為深入,應用廣泛的一種污泥處理處置方法.厭氧消化可有效減少污泥有機質含量和體積,穩定污泥性質,可殺死污泥中大部分病原微生物[2],有利于實現污泥后續無害化利用.在污泥的厭氧消化過程中,營養缺失、高溫、重金屬、高鹽濃度等不利環境因素常會導致病原菌進入有活性但不可培養(VBNC)狀態.VBNC狀態的細菌在常規培養基上不能生長,但仍保持存活狀態并具有代謝活性,被認為是細菌應對不良環境的一種存活機制[3].VBNC狀態的細菌在一定的環境條件下會再次復蘇,因此仍具有潛在的致病性.

污泥厭氧消化工藝主要有中溫厭氧消化(MAD)、高溫厭氧消化(TAD)、高溫-中溫兩相厭氧消化(TPAD).目前研究多集中于 MAD工藝中病原菌殺滅效應,對TAD和TPAD工藝的病原菌殺滅效率關注不多,尤其是對污泥厭氧消化以及后續污泥脫水和野外堆放過程中病原菌VBNC發生情況缺乏研究.此外,VBNC狀態的細菌不能使用傳統的培養方法進行計數,而反轉錄定量 PCR技術(RT-qPCR)通過提取環境樣品的RNA,定量反轉錄mRNA擴增得到cDNA,即可代表微生物在采樣時即時的代謝活性[4].關于細菌VBNC研究多集中于染色和鏡檢的定性研究,RT-qPCR技術具有操作簡便快捷,檢測靈敏度高等特點,可為研究病原菌的VBNC狀態定量研究提供有力手段.

本文針對中溫厭氧消化、高溫厭氧消化、高溫-中溫兩相厭氧消化和高溫短時預處理后中溫消化4種污泥厭氧消化方式,應用MPN培養法和RT-qPCR技術研究了污泥消化以及后續的離心脫水和室溫放置過程中沙門氏菌殺滅和 VBNC發生情況.研究結果有助于了解城市污泥厭氧消化方式和后續處理對腸道病原菌滅活的影響,為評價污泥排放的生物安全性和改善污泥處理工藝及決策提供參考.

1 材料與方法

1.1 污泥來源

污泥取自無錫市某污水處理廠污泥濃縮池.總固體和揮發性有機物質的含量采用重量法,見《水和廢水監測分析方法》[5].pH值使用實驗室用梅特勒-托利多FE20pH計測定.基質污泥的常規指標分析見表1.調節污泥pH值為7.2,接種沙門氏菌純培養物,攪拌均勻,測定基質污泥中沙門氏菌的含量.

表1 基質污泥的基本性質Table 1 The basic properties of substrate sludge used in the experiment

1.2 實驗設置

設置4組厭氧消化反應器,體積為1L,分別采用中溫厭氧消化(MAD)、高溫厭氧消化(TAD)、高溫-中溫兩相厭氧消化(TPAD)和 65℃短時預處理后中溫消化(65℃)的方式,設定中溫消化溫度為35℃,高溫消化溫度為55℃.MAD的污泥停留時間(SRT)為 20d;TAD工藝 SRT為 9d;TPAD高溫相SRT和中溫相SRT分別為5d和7d;65℃+MAD高溫預處理時間為5h,SRT為20d.每個反應器中加入 700mL基質污泥后,充入氮氣 3min去除頂空和液相中的氧氣,密封后根據不同消化方式置于不同溫度下進行厭氧消化.攪拌速度為100r/min.反應器上部設有氣體收集口,下部設有取樣口.厭氧消化實驗結束后,將消化后的污泥進行離心脫水(5000r/min,30min)后置于室溫20d,并將不經過離心脫水的消化污泥作為對照.

1.3 MPN計數法

根據《食品衛生微生物學檢驗沙門氏菌檢驗》[6]中沙門氏菌檢測的基礎進行修正:稱取 5g污泥加入盛有45mL GN增菌液的250mL錐形瓶中,渦旋震蕩 5min,使之混合均勻.用 GN 增菌液稀釋混勻的泥水混合物,得到各個稀釋梯度,每個稀釋度設3個重復,于37℃培養18～24h.然后移取各管中菌液0.5mL加入到裝有5mL四硫酸鈉煌綠增菌液(TTB)的試管中,37℃培養 18～24h.再分別用接種環取各管中的菌液一環劃線接種到亞硫酸鉍瓊脂(BS)平板上,37℃培養40～48h,觀察各個平板上生長的菌落.根據生化鑒定結果,確定MPN結果,用MPN計數軟件計算得出污泥中最大可能的沙門氏菌濃度.

1.4 RT-qPCR定量分析

取2g污泥震蕩混勻,采用土壤RNA提取試劑盒(美國,Mobio公司)進行RNA提取,RNA提取步驟按照說明書進行,提取的RNA樣品于-80℃保存.提取的RNA樣品經DNA降解酶DNase I處理后立即進行RT-qPCR定量.

沙門氏菌擴增基因為 invA[7],擴增引物序列為:5'-ACAGTGCTCGTTTA CGACC-3',5'-ACTGGTACTG ATCGATAAT-3',擴增片段大小為243bp,引物由上海生工生物工程有限公司合成.使用One step SYBR Primescript RT-PCR試劑盒進行RT-qPCR擴增(中國,大連寶生物公司).反應體系為25μL,擴增反應體系為2×One Step SYBR RT-PCR Buffer Ⅲ 12.5μL, TaKaRa Ex Taq HS(5U/Μl) 0.5μL, PrimeScript RT Enzyme MixⅡ0.5μL, PCR Forward Primer(10μmol/L)0.5μL,PCR Reverse Primer(10μmol/L)0.5μL,模板 RNA 2μL,RNase Free dH2O 8.5μL.擴增條件為逆轉錄過程:42℃,30min,95℃,10s;PCR過程共55個循環,條件為 95℃變性 30s,55℃退火 30s,72℃延伸30s.RT-qPCR擴增儀為Qiagen公司Rotor-Gene Q qPCR 擴增儀,實驗數據用Rotor-Gene Q軟件進行分析.所有樣品均進行3次平行實驗.

將提取沙門氏菌純菌液得到的RNA樣品進行10倍梯度稀釋,共9個梯度,將RT-qPCR 定量得到的熒光閾值(Ct)與 MPN計數結果進行線性相關性分析,建立RT-qPCR與MPN兩種計數方法之間的標準曲線.RT-qPCR方法可定量所有具有活性的沙門氏菌,包括可培養的沙門氏菌和VBNC狀態的沙門氏菌.RT-qPCR標準曲線得到的活性菌數量與MPN法得到的可培養細菌數量之間的差值即為VBNC狀態的細菌數量.

1.5 病原菌殺滅動力學分析

實驗中病原菌滅活的動力學常數計算參考下列一級動力學方程.

式中:c為t時刻污泥中病原菌含量,MPN/g DW;c0為初始污泥中病原菌含量,MPN/g DW;k為一級動力學反應速率常數;t為時間,d.運用 OriginPro 8.1軟件結合本文數據進行擬合來計算一級殺滅速率常數.

2 結果與討論

2.1 污泥厭氧消化過程中沙門氏菌的含量變化

65℃+MAD、MAD、TAD和TPAD消化過程中的沙門氏菌含量變化如圖1所示.其中65℃+MAD和TPAD工藝中污泥的初始沙門氏菌含量為 8.7log MPN/g DW(以污泥干重計),TAD 和MAD的污泥初始沙門氏菌含量為9.7log MPN/g DW.污泥經過65℃預處理5h后其中的沙門氏菌含量下降為5.1log MPN/g DW,下降了3.6個數量級,后續的中溫消化d下降為3.1log MPN/g DW,下降了2.0個數量級.MAD污泥經過20d消化后沙門氏菌含量下降為 6.9log MPN/g DW,下降了2.8個數量級.TAD污泥經過9d消化后其中沙門氏菌含量低于檢測限.TPAD污泥經過55℃高溫相 5d消化后其中沙門氏菌含量下降為 2.1log MPN/g DW,下降了 6.6個數量級,后續的中溫消化階段其中沙門氏菌含量低于檢測限.

美國環境保護署(USEPA)根據病原菌的含量,將土地利用的污泥產品分為 A、B兩級[8]:A級要求污泥中的糞大腸菌濃度＜103MPNs/g DW或沙門氏菌濃度＜3MPNs/g DW;B級則要求糞便大腸菌濃度幾何平均值＜2×106MPNs/g DW.歐洲國家對污泥土地利用的沙門氏菌作了相關規定,法國標準要求＜8MPN/10g DW[9],意大利要求＜1000MPN/g DW[10],而波蘭則要求污泥中不許含有沙門氏菌否則不能進行農用[11].我國最新頒布的城鎮污水處理廠污染物排放標準(GB18918–2002)[12]中對污泥土地利用中的沙門氏菌數量沒有明確規定.本研究中,TAD和TPAD工藝消化的污泥中沙門氏菌含量都低于檢測限,未檢出其存在.表明污泥經過TAD和TPAD工藝處理后病原菌含量可達到美國的A級標準.65℃+MAD和 MAD工藝消化的污泥中沙門氏菌濃度則高于各國標準,這與基質污泥中接種了沙門氏菌使得初始沙門氏菌數量很高(108～109MPN/g DW)有較大關系.

圖1 污泥厭氧消化過程中沙門氏菌的含量變化Fig.1 The change in densities of Salmonella spp. in sewage sludge during anaerobic digestions

假設污泥厭氧消化工藝中病原微生物滅活符合一級動力學方程,結合本文數據擬合計算得到的最適一級殺滅速率常數如表 2所示.可見利用一級動力學方程來描述污泥中沙門氏菌失活情況是可行的,4種消化方式中沙門氏菌殺滅均符合一級動力學方程.不同消化方式的沙門氏菌殺滅速率常數也不同,本研究中 65℃+MAD、MAD、TAD和 TPAD的殺滅速率常數分別為39.64,0.21,3.75,2.96d-1.由此可見,溫度升高可加速沙門氏菌的殺滅速率,使得病原菌殺滅率達到穩定狀態所需的時間縮短.

從 4種污泥厭氧消化方式對沙門氏菌的滅活效率來看,其排序為TAD=TPAD＞65℃+MAD＞MAD;從沙門氏菌的殺滅速率來看,排序為 65℃+MAD ＞ TAD＞TPAD＞MAD(表 2).中溫厭氧消化對污泥中沙門氏菌的滅活效果相對較差,殺滅速率相對較慢,而高溫對病原菌的滅活效果顯著增加,尤其是高溫短時預處理使得殺滅速率明顯加快.對于65℃+MAD、TAD、TPAD這3種工藝,高溫是其高溫厭氧消化病原菌滅活的關鍵因素[13],對于大多數病原菌,溫度 55～65℃是其致死溫度.對于MAD工藝,消化溫度35℃是腸道病原微生物生長的適宜溫度.因此,溫度不是中溫厭氧消化病原菌殺滅的首要因素,其他因素如營養物質限制和產甲烷菌等其他厭氧菌的微生物競爭可能是導致消化污泥中病原菌滅活的原因[14].

表2 污泥厭氧消化的沙門氏菌的一級殺滅動力學常數Table 2 First-order inactivation rate constants of pathogens in anaerobic digestions

2.2 消化污泥離心脫水和室溫放置過程中沙門氏菌的含量變化

污水處理廠的消化后污泥通常會經過脫水后外運,本實驗對污泥進行離心脫水并進行室溫放置,比較 4種消化方式的消化污泥在后續處理過程中沙門氏菌的含量變化,結果如圖2a所示.

消化污泥經過離心脫水后沙門氏菌均存在不同程度的數量增加,65℃+MAD污泥脫水后沙門氏菌含量為5.4log MPN/g DW,增加了2.4個數量級.MAD污泥脫水后沙門氏菌含量為8.0log MPN/g DW,增加了 1.1個數量級.TAD污泥脫水后其中沙門氏菌含量為 3.7log MPN/g DW,增加了3.7個數量級.TPAD污泥脫水后其中沙門氏菌含量為2.5log MPN/g DW,增加了2.5個數量級.經過后續的20d常溫放置后,最終TAD和 TPAD中沙門氏菌含量都低于檢測限,65℃+MAD中沙門氏菌含量降低為 2.7log MPN/g DW,MAD污泥脫水后其中沙門氏菌含量下降為4.1log MPN/g DW.

圖2 消化污泥離心脫水后放置和直接放置過程中沙門氏菌的含量變化Fig.2 The change in densities of Salmonella spp. in digested sludge after centrifuge dewatering and without centrifuge dewatering during storage at room temperature

為了比較離心脫水對消化污泥中沙門氏菌數量的影響,同時將部分消化后的污泥不經過離心脫水而直接進行室溫放置,結果如圖 2b所示.其中TAD和TPAD的消化污泥在室溫放置過程中沙門氏菌含量一直低于檢測限,65℃+MAD的消化污泥則一直處于下降趨勢,20d后其含量低于檢測限,下降了3.1個數量級.MAD的消化污泥中沙門氏菌也逐漸減少,放置 20d后降低為4.6log MPN/g DW,下降了2.3個數量級.

由圖 2可知,室溫放置20d,不同消化工藝的消化污泥均有 2～3個數量級的下降,這表明消化污泥在室溫放置過程中可進一步滅活病原菌.這可能是由于室溫放置過程中營養物質不斷被消耗引起的,病原菌因營養物質不足而逐漸減少[14].此外,也可能是消化污泥的理化性質發生了變化引起病原菌生長環境條件的改變,例如VFA、氨氮等物質的累積以及 pH值等,導致了病原菌滅活.產甲烷菌及其他厭氧菌的抑制作用也可能對病原菌滅活有促進作用.

厭氧消化后污泥脫水處理后存在沙門氏菌濃度明顯增加的現象,即病原菌的重新生長現象,且再生長病原菌的數量多少次序分別為TAD＞TPAD＞65℃+MAD＞MAD.Higgins 等[15]研究了消化污泥中糞大腸桿菌群在離心脫水后的復活和生長,結果顯示高溫消化后的污泥離心脫水后大腸桿菌含量增加了約4個數量級.Qi等[16]發現對中溫消化后的污泥離心脫水,糞大腸桿菌含量增加了約 1個數量級,而對高溫消化的污泥離心脫水后,糞大腸桿菌數量顯著增加了幾個數量級.

2.3 污泥厭氧消化過程中沙門氏菌VBNC狀態的發生

圖3 污泥65℃+MAD、MAD、TAD和TPAD過程中VBNC沙門氏菌的含量Fig.3 The logarithmic densities of VBNC Salmonella spp.in sewage sludge during 65℃+MAD、MAD、TAD and TPAD

MPN法屬于傳統的培養法,只能對可培養的細菌進行計數.RT-qPCR方法是通過提取細菌的RNA,然后運用反轉錄PCR將mRNA擴增得到cDNA,然后再運用定量PCR對cDNA進行定量表征.因此,RT-qPCR方法可定量所有具有活性的細菌,包括可培養的細菌和 VBNC 狀態的細菌[17].根據Ct-MPN的標準曲線得到的活性菌數量與MPN法得到的可培養細菌數量之間的差值即為VBNC狀態的細菌數量.

消化前污泥VBNC狀態細菌較少,僅為0.2個數量級(圖 3),甚至具有活性的沙門氏菌數量略低于可培養菌計數結果,這可能是由于 RNA的提取效率或污泥樣品存在 PCR抑制劑導致的.污泥經過TAD和TPAD消化后的VBNC沙門氏菌含量分別為 6.3×103和 1.6×104MPN/g DW,而 65℃+MAD和MAD工藝則分別為63和80 MPN/g DW.

Higgins等[15]利用傳統培養法和qPCR兩種定量方法研究污泥中大腸桿菌的變化時發現,對于高溫厭氧消化污泥,qPCR方法定量的大腸桿菌數量高于傳統培養法計數結果5個數量級,即表明可能有不可培養的病原菌的存在;而對于中溫厭氧消化污泥,qPCR結果高于傳統培養法 1個數量級.以DNA 為基礎的qPCR檢測手段具有一個明顯的缺點,即無法區分細胞的死活,死細胞或自由狀態的DNA 已經沒有危害性卻仍然被檢測出來,導致假陽性結果.而 mRNA 由于在細胞代謝中的中心地位及其非常短暫的半衰期,是細胞存活的一個很好的標志,因此 RT-qPCR技術為研究病原菌的VBNC狀態定量研究提供了有力手段.

目前已有大量不同細菌能進入VBNC 狀態的研究報道,并且VBNC狀態被認為是細菌應對不良環境條件的生存策略[18].寡營養、高/低溫、高壓、pH 值或鹽度的劇烈變化等一些環境因子都可能引起細菌的一系列變化,包括細胞形態變化、主要大分子的密度及結構變化以及在固體或液體培養基中生長能力的改變等,而可能最終導致細菌進入 VBNC 狀態.其中,溫度可能是誘導細菌進入VBNC狀態的最顯著的因子[19],本研究表明了TAD和TPAD的消化污泥中VBNC沙門氏菌含量高于 65℃+MAD 和 MAD消化污泥2～3個數量級,長時間的高溫會促使更多的沙門氏菌進入VBNC狀態.

2.4 消化污泥離心脫水和放置過程中VBNC沙門氏菌含量的變化

消化污泥經過離心脫水處理后VBNC沙門氏菌含量為1～32 MPN/g DW之間,降低了約1～3個數量級.脫水的消化污泥經過室溫放置 20d后,VBNC沙門氏菌數量為10～500MPN/g DW.

表3 消化污泥離心脫水和室溫放置過程中VBNC狀態沙門氏菌的含量(log MPN/g DW)Table 3 The logarithmic densities of VBNC Salmonella spp. in digested sludge after centrifuge dewatering and storage (log MPN/g DW)

針對消化污泥進行離心脫水后其中常見病原指示菌增加的現象,近些年來一些研究者提出了一些觀點:(1)由于對病原菌的計數方法存在客觀的誤差性,可能會導致結果不同,且對消化污泥的計數是對液體中病原菌的計數而對離心脫水后的污泥的計數是對固體中病原菌的計數,可能會引起誤差[16];(2)消化污泥在離心的過程中,由于剪切力的作用,使污泥中含有的能被病原菌利用的營養物質重新暴露,這些暴露出來的營養物質再次被病原菌利用從而導致病原菌再次增加[20];(3)在離心脫水工藝過程中添加的絮凝劑被微生物降解利用,所以被病原菌作為營養基質利用而使病原菌數量增加[21].(4)糞大腸菌數量增加,并不是由于離心過程中微生物的生長,而可能是高溫消化引起糞大腸菌暫時失去活性,此后又恢復活性而造成的[15-16].

本實驗在相同條件下對 4種不同消化方式得到的消化污泥離心脫水后進行計數,得到沙門氏菌含量增加幅度不同,基本排除了計數方法和絮凝劑對病原菌數量增加的影響.分析其原因認為可能是由于高溫的消化過程導致部分沙門氏菌進入VBNC狀態,離心脫水過程中由于剪切力作用導致營養物質釋放或者水相中的VFA和氨氮等抑菌物質濃度下降使得環境條件改變有利于病原菌生長,這時進入VBNC狀態的沙門氏菌開始復活生長,使得 MPN計數法檢測得到的可培養沙門氏菌數量增加,即報道的污泥離心脫水后病原菌再生長現象.Reissbrodt等[22]曾向含大腸桿菌的基質中添加自身誘導物質后發現傳統培養法的計數結果顯著增加,說明環境條件的改善能夠引起處于VBNC狀態病原菌的快速復蘇.

值得注意的是,盡管通過 MPN法檢測的TAD和TPAD工藝消化后以及室溫放置的消化污泥中沙門氏菌已低于檢測限,即可培養的細菌為零,但是仍有2～4個數量級的VBNC狀態沙門氏菌的存在.上述結果表明,MPN法只能檢測可培養的病原菌含量,不能檢測處于VBNC狀態的病原菌,而該部分細菌在適宜條件能復活,仍具有致病性[18].所以傳統培養法應用于污泥中病原菌的檢測需考慮其局限性,根據傳統培養法檢測結果評價污泥排放的生物安全性需慎重.

3 結論

3.1 不同的厭氧消化處理工藝對污泥中沙門氏菌的滅活效果不同,中溫厭氧消化和高溫預處理后中溫消化的沙門氏菌分別降低了2.8和5.6個數量級,高溫厭氧消化和高溫-中溫兩相厭氧消化的滅活效果顯著,經此兩種工藝處理后沙門氏菌含量均低于檢測限.沙門氏菌的殺滅速率常數排序為 65℃+ MAD＞TAD＞TPAD＞MAD.結果顯示高溫對病原菌的滅活效果顯著增加,高溫短時預處理使得殺滅速率明顯加快.

3.2 離心脫水會引起消化污泥中沙門氏菌數量增加現象,經過離心脫水處理,中溫厭氧消化、高溫預處理后中溫消化、高溫厭氧消化和高溫-中溫兩相厭氧消化的消化污泥中沙門氏菌分別增加了1.1、2.4、3.7和2.5個數量級.室溫放置會導致消化后污泥中沙門氏菌含量進一步下降.

3.3 城市污泥經高溫和高溫-中溫兩相厭氧消化后VBNC沙門氏菌數量高于中溫和高溫預處理后中溫消化 2個數量級,表明長時間的高溫厭氧消化易導致沙門氏菌進入VBNC狀態.但經過離心脫水處理后,VBNC沙門氏菌數量明顯降低,約為 1～3個數量級,表明消化后污泥中部分VBNC沙門氏菌在離心脫水過程中出現了復活生長.

[1]Sidhu P S J, Toze G S. Human pathogens and their indicators in biosolids: A literature review [J]. Environment International,2009,35:187-201.

[2]Appels Lise, Baeyens Jan, Degrève Jan, Dewil Raf. Principles and potential of the anaerobic digestion of waste-activated sludge[J]. Progress in Energy and Combustion Science, 2008,34:755-781.

[3]Oliver J D. Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria [J]. FEMS Microbiology Reviews, 2010,34:415-425.

[4]Burtscher C, Wuertz S. Evaluation of the use of PCR and reverse transcriptase PCR for detection of pathogenic bacteria in biosolids from anaerobic digestors and aerobic composters [J].Applied and Environmental Microbiology, 2003, 69:4618-4627.

[5]國家環境保護局《水和廢水監測分析方法》編委會.水和廢水監測分析方法 [M]. 4版.北京:中國環境科學出版社, 2002:423-425

[6]GB 4789.4-2010 食品微生物學檢驗沙門氏菌檢驗 [S].

[7]Carsten S J, William E H. Quantification of mRNA inSalmonella sp.seeded soil and chicken manure using magnetic capture hybridization RT-PCR [J]. Journal of Microbiological Methods,2007,69:315-321.

[8]US Environmental Protection Agency (US EPA), EPA/625/R-92/013. Control of pathogens and vector attraction in sewage sludge (including domestic septage) under 40 CFR part 503[S].

[9]Gantzer C, Gaspard P, Galvez L, et al. Monitoring of bacterial and parasitological contamination during various treatment of sludge[J]. Water Research, 2001,35:3763-3770.

[10]Horan NJ, Fletcher L, Betmal SM, et al. Die-off enteric bacterial pathogens during mesophilic anaerobic digestion [J]. Water Research, 2004, 38:1113-1120.

[11]Board on Environmental Studies and Toxicology (BEST).Biosolids applied to land: Advancing standards and practices [S].Washington, DC: The National Academic Press, 2002.http://www.nap.edu/books/0309084865/html.

[12]GBl8918-2002 城鎮污水處理廠污染物排放標準 [S].

[13]Watanabe H, Kitamura T, Ochi S, et al. Inactivation of pathogenic bacteria under mesophilic and thermophilic conditions [J]. Water Sciences and Technology, 1997,36:25-32.

[14]Smith S, Lang N, Cheung K, et al. Factors controlling pathogen destruction during anaerobic digestion of biowastes [J]. Waste Manage, 2005,25:417-425.

[15]Higgins J M, Chen Y C, Murthy S N, et al. Reactivation and growth of non-culturable indicator bacteria in anaerobically digested biosolids after centrifuge dewatering [J]. Water Research,2007,41:665-673.

[16]Qi Y N, Dentel S K, Herson D S. Increases in fecal coliform bacteria resulting from centrifugal dewatering of digested biosolids [J]. Water Research, 2007,41:571-580.

[17]Oliver J D. The viable but nonculturable state in bacteria [J].Journal of Microbiology, 2005,43:93-100.

[18]Oliver J D. Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria [J]. FEMS Microbiol. Rev. 2010,34(4):415-425.

[19]鄭桂麗,廖紹安,翟俊輝,等.環境中“活的非可培養(VBNC)”細菌的研究進展 [J]. 微生物學免疫學進展, 2004,32(4):58-66.

[20]Olivieri V P, Serai M. Removal of selected pathogens during anaerobic sludge digestion. In: Proceedings of the National Conference on Municipal Sewage Treatment Plant Sludge Management [C]. Sludge Management Series 18, Hazardous Materials Control Research Institute, Silver Spring, MD,1988:18-21.

[21]Chang L L, Raudenbush D L, Dentel S K. Aerobic and anaerobic biodegradability of a flocculant polymer [J]. Water Science Technology, 2001,44(3):461-468.

[22]Reissbrodt R, Rienaecker I, Romanova J M, et al. Resuscitation ofSalmonellaenteric,SerovarTyphimuriumand EnterohemorrhagicE. colifrom the viable but nonculturable state by heat stable enterobacterial autoinducer [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2002,68:4788-4794.