蛋白酶水解馬氏珠母貝肉對鎘解離效果的研究

蒲利民 吳曉萍 王 濤 毛偉杰

（1.廣東省水產品加工與安全重點實驗室，廣東 湛江 524088；2.廣東普通高等學校水產品深加工重點實驗室，廣東 湛江 524088；3.國家貝類加工技術研發分中心（湛江），廣東 湛江 524088；4.廣東海洋大學食品科技學院，廣東 湛江 524088）

鎘是一種對人類健康有害的有毒重金屬［1，2］。隨著中國工業化的快速發展，大量的重金屬以多種方式進入海洋，由此造成水環境中的重金屬鎘的含量不斷增加［3－5］。雙殼貝類屬于濾食性生物，在濾食餌料生物的同時，容易將水中有害物質吸入體內，研究［6，7］表明，貝類對鎘的富集系數可高達105～106，很多地區的貝類鎘的含量嚴重超標。

馬氏珠母貝 （Pinctada martensii）是生產珍珠的主要母貝，也是一種優質的蛋白質源［8］，采珠后除可做飼料等外，還可以進行深加工，制備諸如貝肉罐頭、蛋白質營養液等營養品以及提取功能活性成分如糖胺聚糖等以提高利用率和附加值［9］。但馬氏珠母貝的重金屬鎘的含量很高，且在貝肉的深加工產品中由于濃縮等工藝會導致鎘的含量進一步增大［10］。馬氏珠母貝體內過量的鎘嚴重影響了它的食用安全性和經濟價值。因此探索有效的去除其體內鎘的方法具有重要意義。研究［11］表明，貝類中的鎘主要與大分子蛋白質結合，若想去除貝類中鎘，需先將鎘從蛋白質等大分子中解離出來。

本試驗針對馬氏珠母貝肉中鎘含量超標等問題，利用蛋白酶對馬氏珠母貝肉水解，探討水解條件對鎘的解離效果，優選出適用于馬氏珠母貝肉水解的蛋白酶；分別進行單一酶解試驗和復合酶解試驗，并優化條件，比較不同酶解技術對馬氏貝肉中鎘的解離效果；采用響應面設計方案，建立動態數學模型，優選出對馬氏珠母貝肉具有良好水解效果和鎘解離效果的蛋白酶及其酶解參數。為下一步貝類鎘的脫除奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

馬氏珠母貝：購于湛江市徐聞縣流沙灣珍珠養殖場，將貝去殼取其全臟器用超純水洗凈，瀝干后勻漿，－18℃凍藏備用；

木瓜蛋白酶：3 500U／mg，廣西南寧市龐博生物工程有限公司；

胰蛋白酶：250U／mg，美國Sigma公司；

中性蛋白酶：6萬U／mg，美國Sigma公司；

枯草桿菌蛋白酶：4 000U／mg，廣西南寧市龐博生物工程有限公司；

胃蛋白酶：3 000U／mg，美國Sigma公司。

甲醛、鹽酸、硝酸、硫酸、高氯酸：優級純，廣州化學試劑二廠；

氫氧化鈉：分析純，廣州化學試劑二廠；

鎘標準GBW08612（1.0mg）：國家標準物質研究中心；

試驗用水：超純水，本實驗室自制。

1.1.2 主要儀器設備

電熱恒溫水浴鍋：HHS型，上海博訊實業有限公司；

pH酸度計：PHSJ－4A型，上海精密科學儀器有限公司；

恒溫磁力攪拌器：JB－2型，常州國華電器有限公司；

臺式離心機：TD5型，長沙英泰儀器有限公司；

原子吸收光譜儀：Z－5000型，日本日立公司；

超純水系統：Milli－Q Academic A10型，美國 Millipore

公司。

1.2 方法

1.2.1 總氮、氨基態氮和鎘含量的測定

（1）總氮含量的測定：采用凱氏定氮法［12］。

（2）氨基態氮含量的測定：采用甲醛滴定法［13］。

（3）鎘含量的測定：采用石墨爐原子吸收光譜法［14］。

1.2.2 蛋白酶篩選 選用木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、精制中性蛋白酶、胃蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶5種蛋白酶對馬氏珠母貝肉進行酶解試驗，以鎘解離度為指標，比較5種蛋白酶水解馬氏珠母貝肉對鎘解離度影響的大小。分別在液固比4∶1（V∶m），加酶量4 500U／g，水解時間5h，最適溫度和最適pH條件下，進行水解，測定水解液的鎘含量，按式（1）計算鎘的解離度。

1.2.3 單一酶水解貝肉蛋白質 根據1.2.2篩選出的枯草桿菌蛋白酶做單一酶解試驗，通過單因素試驗和響應面法對水解條件進行優化。

在單因素試驗的基礎上，以水解溫度、pH值、加酶量、液固比和水解時間為考查對象，以馬氏珠母貝肉水解液的鎘解離度為響應指標，利用中心組合設計（central composite design，CCD）方法進行編碼及響應面試驗，Design－Expert 8.0軟件對試驗數據進行統計分析，以獲得枯草桿菌蛋白酶對馬氏珠母貝肉蛋白質水解的最佳水解參數。

1.2.4 雙酶復合水解貝肉蛋白質

（1）復合酶組合比例的選擇：按酶活比例分別為4∶1，3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3，1∶4將枯草桿菌蛋白酶和胰蛋白酶混合。用復合酶對馬氏珠母貝肉進行酶解，酶解條件為液固比3∶1（V∶m），水解溫度50℃，水解時間6h，加酶量為4 500U／g，pH 7.5。計算鎘解離度（因為主要研究對鎘解離度的影響，因而選擇鎘解離度為指標，篩選復合酶及其比例），同時以枯草桿菌蛋白酶和胰蛋白酶的單一酶解試驗結果作為對照，選擇鎘解離度最大的組合比例為復合酶最佳組合比例。

（2）響應面法優化雙酶復合水解條件：以水解溫度、加酶量和水解時間為試驗因素，以鎘解離度和水解得率為響應指標，利用中心組合設計方法進行編碼及響應面試驗，研究各因素對鎘解離度和水解得率的影響，通過模型計算得到雙酶復合水解馬氏珠母貝肉蛋白質的最佳酶解參數，按式（2）計算鎘水解得率。

2 結果與分析

2.1 蛋白酶的篩選

不同蛋白酶對馬氏珠母貝肉的水解效果見表1。由表1可知，枯草桿菌蛋白酶的鎘解離度最高，解離效果最好，是胰蛋白酶次之，因此選擇枯草桿菌蛋白酶為馬氏珠母貝肉酶法解離鎘的最適蛋白酶。

2.2 枯草桿菌蛋白酶水解貝肉對鎘解離度的影響

2.2.1 試驗模型建立和方差分析 由2.1蛋白酶篩選的結果可知，枯草桿菌蛋白酶最適于解離馬氏珠母貝肉中的鎘，因此對其進一步進行條件優化。在單因素試驗基礎上，以貝肉水解液的鎘解離率為試驗指標，設計5因素3水平的響應面試驗，試驗因素和水平表見表2，試驗設計和結果見表3。

表1 不同蛋白酶對馬氏珠母貝肉的水解效果Table 1 Hydrolysates of Pinctada martensii meat by different protease

表2 枯草桿菌蛋白酶單一水解試驗因素和水平表Table 2 Factors and levels central composite design hydrolysis by subtilisin

表3 枯草桿菌蛋白酶單一水解試驗設計方案和結果?Table 3 Central composite design and results of hydrolysis by subtilisin

續表3

用Design－Expert軟件以響應面法中心組合設計原理建立酶解試驗方案，并進行試驗，在因素方差分析中，剔除AB、AE、A2等不顯著的交互因素，得到5因素與鎘解離度 （Y）之間的回歸模型：Y ＝66.16＋4.23A＋4.82B＋4.35C＋9.93 D－4.81E－3.48AD－4.32CD－4.91B2－4.89C2－9.77E2，剔除不顯著交互因素的方差檢驗見表4。

表4 因素方差分析Table 4 Variance analysis of factors

圖1 液固比和時間交互作用影響鎘解離度的曲面圖和等高線圖Figure 1 Response surface plot and contour plot of the effects of Liquid to solid ratio and time on the taxol production

由表4可知，失擬項不顯著（P＝0.153 6＞0.05），回歸方程極顯著（P＜0.000 1），說明模型擬合良好。模型的相關系數R2＝91.76%＞90%，說明模型具有良好的相關性。變異系數（CV）反映模型的置信度，CV值越低模型的置信度越高，此模型的變異系數（CV）為2.405%，說明此模型能較好的反應真實的試驗值。

2.2.2 響應面交互因素作用分析和優化 圖1、圖2分別顯示液固比和溫度交互作用、添加量和液固比交互作用對鎘解離度影響的趨勢圖，從等高線圖可以直觀地反映出兩變量交互的顯著程度，圓形表示交互作用不顯著，橢圓表示顯著，圖1和圖2等高線呈現橢圓型，表明兩個圖對應的交互作用均顯著。

由圖1、圖2的響應面立體圖可以看出，響應值存在最大值。通過軟件分析計算，可以得到鎘解離度的最大預測值為82.843 7%，水解參數條件為時間4.83h，溫度64.87，添加量4 680U／g，液固比5∶1（V∶m），pH值7.56。

考慮到實際操作的方便，將水解條件修正為時間5h，溫度65℃，添加量4 700U／g，液固比5∶1（V∶m），pH 值7.5。在修正條件下對試驗結果進行驗證實驗，測得鎘解離度81.869%，與預測值（82.8437%）基本吻合，表明模型是合理有效的，解離效果較優。

圖2 添加量和液固比交互作用影響鎘解離度的曲面圖和等高線圖Figure 2 Response surface plot and contour plot of the effects of amount of protease add and solid－liquid ratioon the taxol production

2.3 雙酶復合水解貝肉對鎘解離度的影響

2.3.1 復合酶組合比例確定 由表5可知，在胰蛋白酶和枯草桿菌蛋白酶的酶活力比為3∶1時，水解得率、鎘解離度均較優。因此選擇胰蛋白酶和枯草桿菌蛋白酶組合比例為3∶1的復合酶進行復合酶解試驗。

表5 復合酶組合的水解試驗結果Table 5 Complex enzyme hydrolysis of the combination of results

2.3.2 響應面（CCD）試驗設計優化因素的最佳水平 以水解溫度、加酶量和水解時間為影響因素，鎘解離度和水解得率為響應值，根據中心組合設計（CCD）原理，得到3因素3水平的響應面試驗設計方案，因素水平見表6，試驗設計及其結果見表7。

表6 胰－枯復合酶水解試驗因素和水平表Table 6 Factors and levels central composite design hydrolysis by mixed enzymes

復合酶和10g馬氏珠母貝肉在pH值7.0，液固比4∶1（V∶m）下進行酶解試驗，得到3因素與鎘解離度（Y）和水解得率（Z）之間的回歸模型：Y＝84.71＋7.77A＋11.85B＋6.32C－1.84AB＋13.64AC＋0.63BC－9.71A2－11.06B2－16.78C2，Z＝86.12＋1.60A－3.06B＋2.19C＋0.13AB－0.82AC－1.05BC＋0.89A2－4.69B2－0.58C2，對回歸模型進行方差分析，回歸模型的方差檢驗詳見表8和9。

由表8可知，鎘解離度的回歸模型極顯著（P＝0.000 5＜0.01），同時模型中的時間、溫度、添加量和時間與添加量的交互項，以及時間、溫度、添加量顯著（P＜0.05）。鎘解離度回歸模型的方差分析失擬項不顯著 （P＝0.258＞0.05），說明此模型擬合程度較好。變異系數（CV）反映模型的置信度.CV值越低模型的置信度越高，此模型的變異系數（CV）為2.87%，說明此模型能較好地反應真實的試驗值。相關系數R2＝94.2%＞90%，說明模型的相關性好。因此試驗模型可以有效模擬預測試驗結果。

表7 復合酶解試驗設計方案和結果?Table 7 Central composite design and results of enzymatic hydrolysis

表8 鎘解離度的回歸模型方差分析Table 8 Variance analysis of factors Cd

表9 水解得率的方差分析Table 9 Variance analysis of hydrolysis yield

由表9可知，水解得率二次回歸模型極顯著（P＝0.001 1＜0.01），失擬項不顯著（P＝0.287 7＞0.05），說明此模型擬合程度較好。同時模型中時間、溫度、添加量、溫度的二次項均顯著（P＜0.05）。相關系數R2＝94.72%，模型的相關性良好；此模型的變異系數（CV）為1.64%，說明此模型能較好的反應真實的試驗值。因此試驗模型可以有效模擬預測試驗結果。

因此，模型是顯著的。剔除不顯著因素的影響后，得到3因素與鎘的解離度（Y）和水解得率（Z）之間的回歸模型：Y ＝84.71＋7.77A ＋11.85B ＋6.32C ＋13.64AC －9.71A2－11.06B2－16.78C2，Z＝86.26＋1.60A－3.06B＋2.19C－4.67B2。

2.3.3 響應面交互因素作用分析和優化 由表8和表9方差分析得知，只有時間和添加量的交互因素對鎘解離度的影響是顯著的，因此只分析此交互因素的影響。

圖3中等高線呈現橢圓形，表示添加量與時間的交互作用是顯著的；立體圖可以看出，響應值存在最大值。通過軟件分析計算預測最佳的酶解條件是時間5h，溫度50.04℃，添加量5 687.53U／g，最佳鎘解離度能達到87.685 3%，酶解得率達到89.692 8%。根據實際情況修正為時間5h，溫度50℃，添加量5 700U／g，驗證實驗效果良好，鎘解離度為85.523%，水解得率為90.93%和預測結果（89.6928%）接近。

圖3 時間與添加量的交互因素影響鎘解離度的曲面圖和等高線圖Figure 3 Response surface plot and contour plot of the effects of time and solid－liquid ratio on the taxol production

3 結論

本試驗研究了單一酶解、復合酶解對貝肉中鎘的解離影響，以鎘解離度和水解得率為響應指標，利用響應面試驗法確定了雙酶復合水解馬氏珠母貝肉蛋白質最佳酶解條件：枯草桿菌蛋白酶與胰蛋白酶以活力比為3∶1，酶添加量5 700U／g，液固比4∶1（V∶m），pH 值7.0，溫度50℃，酶解時間5h，在此條件下水解得率為90.93%，鎘解離度達到85.52%。研究結果表明試驗中應用的蛋白酶均對貝肉中的鎘有解離的作用，其中枯草桿菌蛋白酶的鎘解離度最高，而復合酶解較單一酶酶解效果更好。

之前本課題組已經報告了有機酸在一定條件下對牡蠣勻漿液中的重金屬鎘具有絡合提取的作用［14］，檸檬酸對馬氏珠母貝勻漿液中鎘的提取率達到92.2%［15］，但水解得率并不高，如馬氏珠母貝肉的總氨基酸含量為13.12g／100g，檸檬酸提取液的總氨基酸含量為2.94g／100g，提取液中總氨基酸含量僅占原貝肉中的22.4%。本次報告的酶法對鎘的解離度略低于檸檬酸提取法，但其蛋白質水解得率較高，提示酶解液中氨基酸等營養物質的利用價值要優于檸檬酸提取液的。用酶解法或有機酸法提取重金屬鎘之后，提取液中重金屬鎘的脫除及脫鎘后提取液中營養成分的再利用有深入研究的必要。

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11 中華人民共和國衛生部.GB 5009.5——2010食品中蛋白質的測定［S］.北京：中國標準出版社，2010.

12 中華人民共和國衛生部，中國國家標準化管理委員會.GB／T 5009.39——2003醬油衛生標準的分析方法［S］.北京：中國標準出版社，2004.

13 中華人民共和國衛生部，中國國家標準化管理委員會.GB／T 5009.15——2003食品中鎘的測定［S］.北京：中國標準出版社，2003.

14 吳曉萍，廖艷，章超樺，等.檸檬酸和琥珀酸提取牡蠣勻漿液中鎘的研究［J］.上海海洋大學學報，2011，20（3）：462～465.

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