逆轉錄環介導等溫擴增技術檢測草莓潛隱環斑病毒的研究

張吉紅， 余澍瓊， 徐 瑛， 張慧麗， 陳先鋒＊， 陳劍平， 陳 炯

（1.寧波出入境檢驗檢疫局，寧波 315012；2.浙江省農業科學院，杭州 310021；3.寧波大學，寧波 315211）

草莓潛隱環斑病毒（Strawberry latent ringspot virus，SLRSV）隸屬于伴生豇豆病毒科（Secoviridae）［1］，是薔薇科果實類作物上的重要病害之一，也是國家質檢總局發布的重要檢疫性有害生物。該病害主要分布在歐洲、美國和俄羅斯等地區。SLRSV能侵染種子、種球、塊莖和苗木等，病毒侵染植株后，主要表現為葉片褪綠、畸形、植株矮化、產量以及品質下降等現象，嚴重時可引起毀滅性災害。SLRSV主要通過長劍線蟲（Xiphinemasp.）傳播，機械、嫁接和種子均可傳播。目前，SLRSV的檢測方法主要有指示植物小葉嫁接法、血清學檢測和分子生物學檢測等。指示植物小葉嫁接法，SLRSV的癥狀表現比較復雜，同種病毒在不同的指示植物上，癥狀變化比較大，而且該方法對于病毒種類的鑒定檢測耗時長；血清學檢測法具有快速簡便和高通量的優點，目前已有10多種草莓病毒或類似病毒可用ELISA進行檢測；另外，實時熒光RT－PCR技術檢測草莓病毒也有報道［2］，該方法具有較高的靈敏度和特異性，但是對設備和人員技術能力的要求較高。

環介導等溫擴增技術（Loop－mediated isothermal amplification，LAMP）作為一種新的核酸擴增方法，具有檢測速度快、操作簡單和靈敏度高等優點。首先，LAMP技術是呈瀑布式擴增，故其擴增效率非常高；其次，LAMP識別靶序列上的6～8個特異性位點，因此特異性很強；再次，LAMP技術是在60～65℃恒溫下擴增，只要恒溫水浴鍋即可，無需特殊儀器，所以操作方便，對設備要求低；最后，LAMP的整個反應周期只需1～2.5h，檢測周期非常短。基于LAMP技術以上的優點，本文針對草莓潛隱環斑病毒的RT－LAMP檢測方法的建立進行了研究報道。

1 材料與方法

1.1 供試材料

含有SLRSV的陽性樣品物質購自美國Agdia公司。經DAS－ELISA檢測呈SLRSV陽性的百合樣品由上海檢驗檢疫局提供。番茄環斑病毒（Tomato ringspot virus，ToRSV）、香石竹環斑病毒（Carnation ringspot virus，CRSV）、黃瓜綠斑駁花葉病毒（Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV）、南芥菜花葉病毒（Arabis mosaic virus，ArMV）以及馬鈴薯V病毒（Potato virus V，PVV）等陽性標準物質也都購自美國Agdia公司。

RT－LAMP引物由上海英駿生物技術公司合成。核酸提取試劑Trizol購自上海生物工程公司。RT－LAMP擴增試劑盒由本實驗室研制。One－step RNA PCR kit與DL－2000marker購自大連 TaKa－Ra公司。

引物序列見表1，根據GenBank（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov）中已登錄的草莓潛隱環斑病毒的外殼蛋白基因序列（AY860979），采用Blast程序進行同源性比較，在序列的保守區，使用Primer Express 3.0軟件，設計得到F3、B3、FIP（F1c＋TTTT＋F2）、BIP（B1c＋TTTT＋B2）、Loop1和Loop2共6條引物，分別識別外殼蛋白編碼基因的8個位點。

表1 草莓潛隱病毒RT－LAMP檢測引物Table 1 The RT－LAMP primers for identification of SLRSV

1.2 草莓潛隱環斑病毒的RT－LAMP擴增

總RNA提取：采用Trizol試劑方法提取［3］。

反應體系：2×RT－LAMP Mix 10μL，引物F3和B3各為0.2μmol／L，Loop1和Loop2的終濃度各為0.8μmol／L，FIP和BIP的終濃度各為1.6μmol／L，Bst DNA聚合酶（5U／μL）1.5μL，AMV RNA 聚合酶（5U／μL）1μL，模板 RNA 1μL，用ddH2O補充至總體積20μL。

LAMP反應液配制完成后，取SYBR green I（10000×）染色劑0.1μL加至反應管的管蓋上，待反應結束，離心反應管使染色劑與反應產物混合。當擴增結果為陽性時，反應液呈綠色，結果為陰性時呈橙紅色。在紫外燈下，陽性樣品管發出白色熒光，無擴增產物的樣品管沒有白色熒光。

反應條件如下：在恒溫60℃的水浴鍋中擴增1h。

RT－LAMP結果分析：反應結束后，取10μL擴增產物進行2.0%瓊脂糖凝膠電泳，在GelDoc－2000（Bio－Rad）凝膠成像系統上觀察并記錄結果。

1.3 RT－LAMP的檢測反應條件優化試驗

以草莓潛隱環斑病毒RNA為模板，按照建立的RT－LAMP檢測方法，分別在60、63℃和65℃3個溫度條件下進行擴增，反應時間為1h。每個溫度條件設置2個RNA樣品重復，一個空白對照。

以草莓潛隱環斑病毒RNA為模板，按照建立的RT－LAMP檢測方法，分別在30、60min和90min 3個時間條件下進行擴增，反應溫度為60℃。每個時間條件設置2個RNA樣品重復，一個空白對照。

1.4 RT－LAMP的特異性和靈敏度試驗

抽提 得 到 SBMV、BPMV、SMV、TRSV 以 及ToRSV等病毒RNA，按照建立的ArMV RT－LAMP檢測方法，進行特異性研究。健康大豆種子提取液作為陰性對照。

以 ToRSV、CRSV、CGMMV、ArMV 以及 PVV等多種植物病毒RNA為模板，按照建立的草莓潛隱環斑病毒RT－LAMP檢測方法，進行特異性研究。其中，草莓潛隱環斑病毒設置2個RNA樣品重復，其余病毒設置1個RNA樣品，并設置1個空白對照。

將提取好的草莓潛隱環斑病毒RNA模板進行10倍系列稀釋，得到10－1～10－5稀釋的病毒RNA樣品。采用建立的RT－LAMP和RT－PCR方法進行擴增靈敏度比對試驗。

1.5 草莓潛隱環斑病毒RT－PCR檢測方法的建立

RT－PCR 反 應 體 系 參 照 One－step RNA PCR kit試劑盒說明進行，其中引物為F3和B3。反應條件如下：50℃cDNA合成30min，94℃預變性2min；94℃變性30s，58℃復性30s，72 ℃延伸1min，35個循環；最后72℃延伸5min。

1.6 RT－LAMP擴增產物的觀察

將靈敏度試驗中的RT－LAMP擴增產物，用凝膠電泳法觀察擴增結果，剩下的產物中，直接加入0.1μL的熒光染料SYBR green I，混勻后肉眼觀察顏色變化，或置于凝膠成像系統中紫外觀察。

1.7 百合樣品中SLRSV的RT－LAMP快速檢測

取已用DAS－ELISA檢測呈SLRSV陽性的進境百合樣品，采用本研究建立的RT－LAMP方法進行擴增檢測，結果采用SYBR green I染色觀察。

2 結果與分析

2.1 RT－LAMP的檢測反應溫度優化試驗結果

在相同反應時間，本試驗設計的草莓潛隱環斑病毒的引物在60、63℃和65℃均出現明顯的條帶（圖1），擴增產物亮度在3個不同溫度之間沒有明顯的差異，反應溫度最終確定為60℃。

圖1 SLRSV RT－LAMP方法的溫度優化Fig.1 Optimization of temperature in RT－LAMP for SLRSV

2.2 RT－LAMP的檢測反應時間優化試驗結果

在60℃時，本試驗設計的草莓潛隱環斑病毒的引物在60min和90min均出現明顯的條帶（圖2），但在30min條件下未出現擴增條帶，反應時間確定為60min。

圖2 SLRSV RT－LAMP檢測的時間優化Fig.2 Optimization of time in RT－LAMP for SLRSV

2.3 草莓潛隱環斑病毒的RT－LAMP特異性擴增結果

草莓潛隱環斑病毒的陽性標準物質經過RTLAMP擴增后，能夠得到特異性的瀑布狀條帶，而其他病毒毒株的RNA模板則無擴增條帶出現，空白對照中無特異性基因條帶（圖3）。這表明本研究設計的6條引物針對SLRSV的檢測具有非常好的特異性。

圖3 RT－LAMP特異性擴增SLRSV結果Fig.3 Specificity results of LAMP for SLRSV

2.4 RT－LAMP檢測靈敏度試驗

不同稀釋梯度的草莓潛隱環斑病毒RNA經過RT－LAMP擴增后，其檢測靈敏度為10－3病毒稀釋液，比普通RT－PCR的靈敏度高出100倍（圖4）。

圖4 RT－LAMP和RT－PCR檢測SLRSV靈敏度結果Fig.4 Sensitivity results of RT－LAMP and RT－PCR for SLRSV

2.5 擴增產物的結果觀察

本研究利用沉淀法和染色法對LAMP產物進行了檢測。LAMP沉淀較少，肉眼較難分辨沉淀的有無；LAMP產物中加入SYBR green I染色劑，對照顏色呈橙紅色，而有擴增產物則呈綠色（圖5a）。在紫外燈下觀察，空白對照和無RT－LAMP產物的樣品管均沒有發出白色熒光，而有RT－LAMP擴增產物的樣品管則發出白色熒光，且白色熒光的亮度與RNA模板濃度的高低成正比（圖5b）。RTLAMP擴增產物，用凝膠電泳法觀察結果和用熒光染料SYBR green I觀察的結果一致。

圖5 熒光染料SYBR green I處理RT－LAMP產物的觀察結果Fig.5 Observation of RT－LAMP products treated by SYBR green I

2.6 百合樣品中SLRSV的RT－LAMP快速檢測結果

采用本研究建立的RT－LAMP方法對百合SLRSV陽性樣品進行檢測，并用熒光染料SYBR Green I法觀察，結果顯示，陽性樣品均顯示明顯的綠色。

圖6 RT－LAMP檢測百合樣品中SLRSV的結果Fig.6 Detection of SLRSV in the lily by RT－LAMP

3 討論

目前，草莓潛隱環斑病毒的主要檢測方法為ELISA和RT－PCR技術。兩種方法較以前的生物學接種方法來說，在靈敏度、特異性和檢測周期等方面已有了很大的進步，但是檢測周期仍然在3.5h以上，耗時長，在現場快速檢驗方面仍顯不足；另外，RT－PCR技術在產物擴增和結果判斷方面，均對設備要求較高，不便于口岸對病毒檢測的快速篩查。

張躍偉等應用熒光顯色檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV），結果顯示，在敏感性檢測中，RTLAMP與RT－PCR都能檢測包含靶基因片段的重組質粒，熒光顯色劑判斷的結果與濁度判斷結果一致［4］；何琳等建立了白斑綜合征病毒環介導等溫擴增快速檢測方法，同時與巢式PCR進行了比較分析，結果為最適反應在64℃，恒溫條件60min內完成，靈敏度較巢式PCR高出100倍，在1h內即可完成檢測［5］；劉佳等建立的LAMP技術檢測菊花中番茄不孕病毒的方法為65℃保溫1h，加入2μL稀釋10倍的SYBR Green I，結果表明該方法檢測番茄不孕病毒具有高效、快速和靈敏度高等特點［6］。孫穎杰等建立了牙鲆彈狀病毒環介導等溫擴增（LAMP）檢測方法，該方法的檢測限為30fg RNA，比常規RT－PCR靈敏度高出100倍，與其他病毒沒有交叉反應，檢測時間短，在1h內即可完成檢測［7］。

LAMP反應后打開蓋加染色劑及使用凝膠電泳驗證會造成不必要的污染過程，使結果出現假陽性。因此本研究LAMP檢測方法進行優化時采用電泳觀察的方式，以選擇最佳的反應體系，從而提高草莓潛隱環斑病毒檢測效率。但在實際檢測過程中，該方法采用在LAMP反應管蓋上滴加SYBR green I染色劑，待反應結束后在不開蓋的情況下直接使染色劑與擴增產物混合，以此減少反復開蓋而造成的污染問題。

本試驗的LAMP檢測方法在1.5h內完成了檢測的全過程，耗時短；產物擴增只需要恒溫水浴鍋，對設備要求低；試驗發現，本研究建立的RTLAMP檢測方法比RT－PCR的靈敏度高出100倍；且特異性好；結果判斷時在LAMP反應體系中加入0.1μL熒光染料SYBR green I，反應結果通過肉眼觀察綠色是否生成而進行判定，實現反應及產物檢測一步完成，其判斷結果和瓊脂糖凝膠電泳結果完全一致，快速準確方便；另外，本研究取已用DAS－ELISA檢測呈SLRSV陽性的進境百合樣品進行試驗，準確率達到100%。本研究建立的方法適合植物中草莓潛隱環斑病毒的現場篩查及實驗室快速檢測。

［1］ Sanfacon H，Iwanami T，Karasev A V，et al.Family Secoviridae.［M］∥King A M Q，Adams M J，Carstens E B，eds.Virus Taxonomy：Ninth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Elsevier／Academic Press， Amsterdam， 2012：881－899.

［2］ 周厚成，何水濤.草莓病毒病研究進展［J］.果樹學報，2003，20（5）：421－426.

［3］ 聞偉剛，崔俊霞，趙秀玲，等.半巢式RT－PCR檢測進口大豆中菜豆莢斑駁病毒的研究［J］.植物病理學報，2006，36（4）：296－300.

［4］ 張躍偉，李旭妮，郭盼盼，等.熒光顯色在環介導等溫擴增（LAMP）檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的應用［J］.農業生物技術學報，2010，18（3）：508－513.

［5］ 何琳，徐海圣，王美珍，等.白斑綜合征病毒環介導等溫擴增快速檢測方法的建立［J］.水產學報，2010，34（4）：598－603.

［6］ 劉佳，黃叢林，吳忠義，等.環介導等溫擴增技術檢測菊花中番茄不孕病毒［J］.中國農業科學，2010，43（6）：1288－1294.

［7］ 孫穎杰，岳志芹，劉葒，等.牙鲆彈狀病毒環介導等溫擴增檢測方法的建立與應用［J］.華中農業大學學報，2010，29（2）：203－207.