火炮打擊兔應激防護模型腦組織病理及NMDA-R1表達的形態學研究

周龍 張建華 林進皇 俞雄杰 郁毅剛

火炮打擊兔應激防護模型腦組織病理及NMDA-R1表達的形態學研究

周龍 張建華 林進皇 俞雄杰 郁毅剛

目的 探討實彈演習火炮打擊后, 不同位置掩體保護下兔腦組織病理及NMDA-R1表達的變化。方法 閩南山地團進攻演習, 30只實驗兔隨機分為空白對照組, 反角隱蔽組和迎面隱蔽組。火炮打擊應激損傷后6 h, 各組存活兔取腦組織, 觀察其病理損傷形態學及NMDA-R1表達的變化。結果 與空白對照組比較, 反角隱蔽組和迎面隱蔽組NMDA-R1表達強陽性, 腦組織結構層次被破壞, 神經細胞變性壞死, 間質出血；迎面隱蔽組NMDA-R1免疫反應強度亦高于反角隱蔽組。結論 火炮打擊后兔腦組織應激損傷反應強烈, 反角掩體保護能夠減輕腦組織損傷, NMDA-R1參與腦組織損傷病理過程。

火炮打擊；兔；應激防護模型；腦組織；NMDA-R1

正常情況下機體的應激反應是有利的, 有助于機體快速適應內外環境因素的變化, 但過大過長的應激反應會對機體產生有害的影響, 產生病理性應激［1］。病理性應激是機體對嚴重應激因素(如創傷、打擊、爆炸等)的一種異常反應,其生理過程主要表現為下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamopituitary-adrenal, HPA)軸神經內分泌調節功能紊亂, 導致持續過度的糖皮質激素升高［2］。近年來, 人們發現N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartate receptor, NMDAr)的變化與創傷后神經-內分泌-免疫功能紊亂的發生機制有關［3］。本課題通過建立火炮打擊兔應激防護模型, 進行應激狀態下兔腦組織病理變化及NMDA-R1表達的形態學研究, 現報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要儀器、動物及試劑 團進攻炮火覆蓋火力類型：武裝直升機火箭彈、XX自行榴彈炮、XX牽引加農炮、XX自行火箭炮、水陸兩棲坦克、XX輪式突擊炮、XX迫擊炮、XX反坦克導彈。健康成年日本大耳白兔30只, 雌雄不拘,清潔級, 體質量2.5～3.0 kg(廈門大學醫學院動物中心提供),隨機表法分為3組, 空白對照組6只, 反角隱蔽組6只, 迎面隱蔽組18只(距離攻擊目標10 m隱蔽組6只, 20 m隱蔽組6只, 3 0 m組隱蔽6只)。

1.2 實驗方法 按照文獻［4］方法設計實驗, 實驗時間和環境條件為南方秋季中午山地環境, 環境溫度16℃～28℃, 濕度43%～65%。實驗兔常規喂養, 演習當日凌晨運至目標高地,炮靶前迎面10 m、20 m、30 m處挖掘約1 m深掩體, 各放置實驗兔6只, 上覆蓋硬質木板、松枝, 留通氣道。炮靶后反角10 m處挖掘同樣掩體, 放置實驗兔6只。空白對照組于炮靶陣地外10 km營區喂養。中午演習開始, 全過程2 h。轟炸機俯沖(未投彈), 持續火炮急襲5 min。各型火炮、坦克、導彈、武裝直升機集群連續發彈若干, 期間暫停兩次, 各10 min。演習結束, 工兵排爆清理陣地后進場取回實驗兔。傷后6 h處死存活兔解剖, 取腦組織標本, 4%甲醛固定。

1.3 腦組織病理檢測 取4%甲醛固定腦組織, 石蠟包埋,切片行HE染色, 光鏡下觀察形態學變化, 由同一病理醫生采用盲法評價。觀察腦組織結構層次是否完整, 神經細胞腫脹、變性、壞死, 間質出血、水腫等情況。

1.4 腦組織NMDA-R1免疫組化表達的測定 取4%甲醛固定腦組織, 石蠟包埋, 連續切片(4 μm), 每例標本切5張免疫組化染色用。采用改進型SP法進行免疫組化染色, 嚴格參照試劑盒說明操作。試劑盒型號, 購于XX公司。每次染色時均用已知陽性切片作陽性對照, 用PBS(磷酸緩沖液, 0.01 mol/L, pH值7.2)代替一抗作陰性對照。NMDA-R1表達均位于胞質和胞核內, 表現為淺黃、棕黃或棕褐色。用半定量法評估其染色, 無陽性細胞數為(-), 陽性細胞數25%以下為(+), 25%～50%為(++), 51%～75%為(+++), 超過75%為(++++)。

2 結果

2.1 兔一般情況 各組實驗兔均無直接火力命中。與空白對照組比較, 反角隱蔽組實驗兔全部存活, 部分精神萎靡,反應遲鈍, 伏地, 少部分耳道出血。因彈著點不規律, 迎面隱蔽3組距離無差異, 合并為1組。迎面隱蔽組18只實驗兔當場死亡9只, 至傷后6 h取腦組織標本前再死亡3只,死亡率達66.7%(12/18)。剩余6只存活實驗兔編為迎面隱蔽組, 與另外兩組同時刻點取腦組織進行病理形態學及組化檢測, 每只取五張切片進行組化表達強度及形態學觀察研究。

2.2 腦組織HE染色結果 空白對照組腦組織切片HE顯示, 分子層, 內、外顆粒層及錐體細胞層結構完整, 均勻致密；錐體細胞數量豐富, 胞體致密, 核居中, 軸突完整、干凈,向四周延伸；間質為少量血管及白質, 肌漿深染, 膠質豐富,可見散在分布血管, 腔內可見少量紅細胞, 未見炎癥細胞(圖1、圖2)。反角隱蔽組腦組織切片HE顯示, 分層結構存在,錐體細胞數量減少, 胞體稍腫脹, 可見空泡變性, 軸突斷裂；細胞間少量紅細胞分布, 間質少量炎細胞浸潤(圖3、圖4)。迎面隱蔽組腦組織切片HE染色顯示, 細胞結構層紊亂, 分界不清, 部分壞死, 崩解；細胞數明顯減少, 胞體腫脹, 體積增大, 軸突消失, 白質稀疏；間質充血, 可見散在紅細胞分布及漿細胞浸潤(圖5、圖6)。

2.3 腦組織NMDA-R1免疫組化的表達 各組神經元錐體細胞中均有NMDA-R1表達, 主要在神經元膜表面表達, 免疫反應強度有差異。空白對照組可見神經元形態完整、胞膜淡染, NMDA-R1蛋白少量表達(+)(圖7、圖8)。反角隱蔽組可見神經元胞體腫脹, 細胞數量減少, 細胞膜典型黃染, NMDA-R1中量表達(++)(圖9、圖10)。迎面隱蔽組, 可見大量神經元壞死崩解, 殘存神經元形態數量稀少, 胞體腫脹, 體積巨大, 胞核溶解, 大部分胞質、胞膜均黃染, 色深, NMDA-R1大量表達(++++)(圖11、圖12)。迎面隱蔽組、反角隱蔽組NMDA-R1免疫反應強度均高于對照組, 同時迎面隱蔽組NMDA-R1免疫反應強度亦高于反角隱蔽組。

圖1 空白組HE染色(×100)

圖2 空白組HE染色(×400 )

圖3 反角組HE染色(×100)

圖4 反角組HE染色(×400)

圖5 迎面組HE染色(×100)

圖6 迎面組HE染色(×400 )

圖7 空白組Nr1組化(×100)

圖8 空白組Nr1組化(×400)

圖9 反角組Nr1組化(×100)

圖10 反角組Nr1組化(×400)

圖11 迎面組Nr1組化(×100)

圖12 迎面組Nr1組化(×400)

3 討論

爆炸及爆炸應激性腦損傷是戰爭中人員遭受的一種多發而又嚴重的顱腦損傷, 在美軍近年的軍事行動中, 爆炸沖擊波性腦損傷的發生率約為40%～60%, 約有32萬服役人員或戰士遭受過爆炸沖擊波腦損傷［5］, 即使爆炸外圍沒有直接受到沖擊波影響的戰士, 也因爆炸應激性損傷而導致腦組織及細胞發生相應的生理病理變化［6］。有報道顯示［2］, HPA軸系統在應激反應調控中的作用與NMDA-R活化有著密切的聯系。因此, 為了了解爆炸及爆炸應激狀態下腦組織損傷的病理生理機制, 作者建立火炮打擊兔應激防護模型, 進行應激狀態下兔腦組織病理變化及NMDA-R1表達的形態學研究。結果提示：與空白對照組比較, 反角隱蔽組和迎面隱蔽組腦組織病理切片及免疫組化均可見腦細胞結構層紊亂, 部分神經元變性、壞死、崩解, 細胞數減少, 胞體腫脹, 體積增大, 胞核溶解, 細胞間質充血, 漿細胞浸潤等腦組織損傷的病理表現, 并且迎面隱蔽組上述表現更明顯和嚴重。同時, 迎面隱蔽組腦組織NMDA-R1大量表達(++++), 反角隱蔽組腦組織NMDA-R1中量表達(++), 而空白對照組腦組織NMDA-R1少量表達(+), 與腦組織病理損傷結果具有一致性。以上結果表明, NMDA-R1參與了爆炸及爆炸應激狀態下腦組織病理損傷過程。

NMDA-R是一種興奮性氨基酸的特異性離子型受體, 它與學習、記憶及神經系統生長發育的可塑性都有密切關系,主要分布于大腦皮層、丘腦、紋狀體、海馬等的突出后膜上, NMDA-R通道對Ca2+具有高度通透性, 在正常生理條件下, 由于離子通道內部Mg2+的阻滯作用, 通道并不開放［7,8］。NMDA-R參與興奮性突觸傳遞、神經遞質釋放等生理活動,其參與腦組織病理損傷的機制為：①NMDA-R1激活HPA軸促進腎上腺皮質激素的分泌和釋放。Son等［9］通過實驗證實應激狀態下腦海馬內NMDA-R1水平存在明確的改變。嚴重創傷應激后海馬NMDA-R激活, 下調海馬糖皮質激素受體進而影響糖皮質激素在海馬水平的負反饋調節, 導致HPA軸亢進, 內源性糖皮質激素過度增多［10,11］。現已證實, 過度升高的內源性糖皮質激素是病理性應激損傷的主要因素之一, 影響神經系統的突觸可塑性［12］。②介導興奮性氨基酸的神經毒性作用。谷氨酸是中樞神經系統中重要的興奮性神經遞質, NMDA-R是其特異性離子型受體, 腦損傷時腦細胞外谷氨酸濃度大量增加, NMDA-R1迅速被激活, 并誘導神經元興奮毒性、激發神經元的退化及神經細胞死亡等過程。岳少杰等［13］研究表明谷氨酸可致膠質細胞的腫脹、壞死及海馬區神經細胞凋亡；Ros等［14］也報道谷氨酸可導致大腦皮層損害。③參與繼發性腦組織水腫及創傷應激產物的形成。有報道證實［15］：NMDA-R1過度激活可介導Na+主動內流,隨即Cl-、水被動內流, 神經細胞急性滲透性腫脹；同時, 其過度興奮介導的神經元遲發性損傷, 以Ca2+內流為特征并激活膜磷脂酶活性, 引起白細胞三烯、前列腺素和花生四烯酸等產生增多, 導致脂質過氧化和自由基形成, 激活各種蛋白酶導致細胞骨架降解, 細胞裂解。④介導炎癥反應性損傷, NMDA-R數量的增加可導致細胞對炎癥的敏感化, 加重繼發性炎癥反應性腦損傷, 而NMDA-R在神經細胞膜上的表達量是調節神經細胞炎癥應激強度的關鍵［16］。

綜上所述, 通過觀察實彈演習對火炮打擊兔應激防護模型的實驗研究, 作者探討戰場環境下火炮打擊應激復合損傷-保護因素對腦組織病理損傷的特點, 為戰爭環境下顱腦爆炸沖擊及爆炸應激傷的診治提供了新的思路。

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Morphological study on NMDA-R1 expression and pathology research on injury brain tissue of artillery attacking stress protective rabbits model

ZHOU Long, ZHANG Jian-hua, LIN Jin-huang, et al.Department of Trauma Neurosurgery, 175th Hospital of PLA Dongnan Hospital Affiliated to Xiamen University, Zhangzhou 363000, China

Objective To study the NMDA-R1 expression and pathology on injury brain tissue in rabbits hidden in different positions of blindage after real artillery attacking in battlefield.Methods 30 Japanese white rabbits were randomly divided into 3 groups, blank group, reverse hidden group and frontage hidden group in mountain regiment artillery attacking maneuver at southern of Fujian.The NMDA-R1 expression and pathology on injury brain tissue in rabbits were observed and recorded in 6 hours after injury.Results Compared with the blank group, the NMDA-R1 expression in reverse hidden group and frontage hidden group were strong positive, brain tissue structure were destroyed, nerve cells degeneration necrosis and brain tissue i nterstitial hemorrhage.Tthe NMDA-R1 expression in frontage hidden group were stronger than reverse hidden group.Conclusion The stress injury response is very strong in rabbits attacked by artillery, reverse blindage protection can reduce degree of brain tissue injury, NMDA-R1 participates in brain tissue injury pathological process.

Artillery attack; Rabbit; Stress protective model; Brain tissue; NMDA-R1

全軍十一五醫學科研基金面上項目(項目編號：06MB152)；福建省漳州市科技計劃項目(項目編號：Z10071)；南京軍區醫學科技計劃項目(項目編號：12MA065)

363000 漳州,解放軍第一七五醫院暨廈門大學附屬東南醫院神經外科(周龍 林進皇 郁毅剛)；解放軍73131部隊(張建華 俞雄杰)

郁毅剛 E-mail：yu-yg@tom.com