畫眉草多糖提取及其保濕性能研究

祝士惠，孫培冬，李海洋

江南大學化學與材料工程學院食品膠體與生物技術教育部重點實驗室，無錫 214122

畫眉草(Herba Eragrostidis Pilosae)原產地為埃塞爾比亞，在當地作為谷物種植。由于它在干旱和洪澇等惡劣氣候條件下均能存活［1］，因此在世界各地廣泛分布，在我國的東北、華北、華東及華南均有生長。畫眉草富含礦物質［2］和蛋白質［3］，《植物名實圖考》、《東北常用中草藥手冊》等書中記載畫眉草具有清熱解毒、化瘀止血、治淋證、跌打損傷、腎盂腎炎、尿路感染、膿皰瘡等功效。目前國內對畫眉草的研究較少，對其活性成分及應用未見報道。

近幾年來從天然植物中提取具有營養和保濕雙重功效的天然保濕劑是研究的熱點，天然多糖是其中最重要的營養保濕材料［4}。本文用纖維素酶超聲輔助法從畫眉草中提取多糖，對其結構進行了初步鑒定，探究了畫眉草多糖的保濕及吸濕性能，為開發利用畫眉草資源提供了思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料與試劑

畫眉草，屬大畫眉草品種，采自山東省煙臺市山區。無水乙醇、丙酮、乙醚、濃硫酸、苯酚、硫酸銨、碳酸鉀、甘油、聚乙二醇400，1，3-丁二醇，纖維素酶、DEAE-纖維素，均為分析純，國藥化學有限公司;低粘度殼聚糖，Sigma公司;葡聚糖凝膠G-50，上海雅吉生物科技有限公司;透析袋3500 Da，上海聚源生物科技有限公司;單糖標準品，Sigma公司。

1.1.2 儀器

粉碎機(JFSD-100-II型，上海嘉定糧油儀器有限公司);旋轉蒸發儀(RE5203型，上海亞榮生化儀器廠);超聲波儀器(BX3300LH型，上海新苗醫療器械有限公司);紫外-可見分光光度計(TU-1901型，北京普析通用儀器有限公司);傅里葉紅外光譜儀(FALA2000101型，Boman公司);高效液相色譜儀(HP1100型，美國安捷倫有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取、分離純化

稱取畫眉草100 g，粉碎后用體積分數80%的乙醇80℃下脫脂2 h;過濾，取濾渣晾干，加入纖維素酶1 g，在固液比1∶20，pH=5，溫度50 ℃ ，時間4 h條件下水提取。然后在頻率40 KHz的超聲儀器中超聲10 min，90℃滅活，過濾得濾液。旋轉蒸發濃縮濾液，加4倍體積乙醇沉淀，離心收集沉淀，依次用乙醇、丙酮、乙醚洗滌，沉淀物真空干燥得粗糖浸膏。將粗糖加200 mL水溶解，用加入質量分數30%胰蛋白酶脫蛋白、活性炭脫色后，用乙醇沉淀并洗滌得混合多糖，混合多糖得率為3.45%。最后將混合多糖經DEAE-纖維素柱層析，用蒸餾水、0.1、0.3、0.5 mol/L 的 NaCl洗脫，用苯酚-硫酸法［5］測定洗脫曲線，合并單一洗脫峰的多糖液體經透析脫鹽后，真空干燥得到純化后多糖。采用Sephadex G-50凝膠柱層析，用0.1 moL/L的NaCl為洗脫液，對得到的純化后多糖進行純度鑒定。

1.2.2 分子量測定

稱取一定量的純化后多糖，配成質量濃度為5 mg/mL的水溶液，采用高效凝膠滲透色譜儀(HPGPC)測定多糖分子量分布［6］。色譜條件:色譜柱Ultrahydrogel Linear，長度3 m，內徑7.8 mm;2410 示差折光檢測器;流動相0.1mol/L NaNO3溶液;流速0.9 mL/min;柱溫45 ℃。

1.2.3 單糖成分分析

樣品配制成質量濃度5 mg/mL，取200 μL加入4 mol/L的三氟乙酸，用氮氣封管在110℃下水解2 h。冷卻到室溫，旋轉蒸發除去三氟乙酸。采用高效離子色譜法(HPIC)，進行單糖組成分析，通過與標準品保留時間的對比，確定多糖中單糖的組成。

色譜條件:分離柱CarboPacTMpA20預處理柱、CarboPacTMpA20檢測柱;脈沖安培檢測器;流動相0.5 mmol/L的NaOH作淋洗液;淋洗方法采用單一濃度淋洗;流速0.45 mL/min;溫度30℃。

1.2.4 吸濕和保濕性能

將飽和硫酸銨溶液、飽和碳酸鉀溶液分別置于干燥器內，放置于20℃的恒溫箱中，制成相當濕度為81%和43%的環境［7］。

稱取多糖 TPS1、TPS2、TPS3 各 0.10 g，分別置于相對濕度RH 43%和81%的密閉容器內吸濕12 h后稱重求吸濕率［8］。吸濕率 (%)=(w1-w0)×100/w0，w0和w1為樣品吸濕前、后的的重量。配制質量分數1%的多糖TPS1、TPS2、TPS3溶液，置于相對濕度RH 43%和81%的環境中，12 h后稱重求保濕率。保濕率(%)=H1×100/H0，H1、H0為放置前后溶液中水分重量。

選取吸濕和保濕性能最好的TPS2多糖，與常用保濕劑甘油、聚乙二醇400、1，3-丁二醇、殼聚糖在不同時間后比較其保濕和吸濕性能，操作同上。

2 結果與討論

2.1 提取、分離純化

畫眉草經纖維素酶-超聲輔助提取，粗糖的提取率為30.52%。粗糖經脫蛋白后，紫外檢測在260 nm和280 nm處均無吸收，表明混合多糖中不含蛋白質［9］。混合糖經DEAE-纖維素柱分離純化，洗脫曲線見圖1。

根據洗脫曲線收集得到3種多糖，以水為洗脫劑得到一種中性多糖 TPS1，0.1、0.3 mol/L 的 NaCl洗脫分別得到兩種酸性多糖TPS2、TPS3。真空干燥，純化后3種多糖TPS1、TPS2、TPS3的得率分別為 0.42%、0.66%、0.54%。

采用Sephadex G-50凝膠柱層析，用0.1moL/L的NaCl為洗脫液對3種多糖進行洗脫，3種多糖均得到單一對稱峰，洗脫曲線如圖2所示。

2.2 多糖的分子量測定

高效凝膠滲透色譜(HPGPC)分析得到3種多糖TPS1、TPS2、TPS3的均重分子量分別為7886 Da、8467 Da、6366 Da。

2.3 單糖成分分析

通過標準品的保留時間，確定多糖的單糖組成，TPS1、TPS2、TPS3水解后經高效離子色譜(HPIC)分析結果見下圖。

圖3 TPS1、TPS2、TPS3 的離子色譜圖Fig.3 Ion chromatogram of TPS1、TPS2、TPS3

通過與單糖標準品離子譜圖對比可知，TPS1組成單糖為果糖，TPS2、TPS3均含有阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、核糖、一種未知糖。TPS2多糖中葡萄糖含量最高，為44.0%。TPS3果糖含量最高，為45.5%。

表1 多糖12 h后的吸濕和保濕率Table 1 The absorption and retention rate of actors level of polysaccharides after 12 hours

2.4 多糖的吸濕和保濕性能研究

2.4.1 多糖的吸濕和保濕性能比較

從表1可以看出:3種多糖在相對濕度(RH)43%的環境中，TPS2的吸濕和保濕率略高于其它兩種多糖;但在相對濕度(RH)81%的環境中，TPS2表現出了明顯的吸濕和保濕性能，所以對吸濕和保濕性能優良的TPS2進行了進一步的研究。

2.4.2 TPS2吸濕性隨時間的變化

TPS2多糖、甘油、聚乙二醇400、殼聚糖各的吸濕率測定結果見圖3，在相對濕度為43%條件下，吸濕率大小為TPS2＞聚乙二醇400＞甘油＞殼聚糖，TPS2的吸濕性能明顯高于聚乙二醇400、甘油和殼聚糖。TPS2在24 h之前吸濕率變化比較顯著，在36 h后吸濕率變化緩慢，吸濕率基本達到飽和狀態，48 h達到最大吸濕率為36.14%。殼聚糖在12 h后吸收率就達到飽和;聚乙二醇400和甘油的吸濕率均隨著時間的增加而增大，48 h時聚乙二醇400和甘油的吸濕率相當。在相對濕度為81%條件下，TPS2表現出了良好的吸濕性能，隨著時間的增加吸濕率不斷增加，48 h后仍未達到吸濕飽和，最大吸濕率為70.65%。殼聚糖在12 h后達到吸濕平衡，甘油和聚乙二醇400在36 h后吸濕率變化緩慢，最大吸濕率均低于41%。從圖3可以看出，多糖TPS2有顯著的吸濕效果，最大吸濕率明顯高于聚乙二醇400、甘油和殼聚糖常用保濕劑。

圖4 TPS2和常用保濕劑吸濕率隨時間的變化圖Fig.4 Relationship between moisture absorption rate and time.

2.4.3 TPS2保濕性隨時間的變化

配制質量分數為1.0%的多糖TPS2溶液、聚乙二醇400溶液、殼聚糖溶液和5.0%的甘油溶液，分別置于相對濕度RH 43%和RH 81%的密閉容器內，保濕率測定結果見圖5。

圖5 3種多糖和常用保濕劑保濕率隨時間的變化圖Fig.5 Relationship between moisture retention rate and time

在相對濕度為43%條件下，TPS2、甘油、聚乙二醇400、殼聚糖的保濕率均隨著時間的變化而減少，保濕率大小為TPS2＞殼聚糖＞甘油＞聚乙二醇400，TPS2未表現出明顯的保濕效果。在相對濕度為81%條件下，TPS2的保濕率隨著時間的變化先增大后減少，在24 h時達到最大，保濕率103.29%，保濕率明顯高于甘油、聚乙二醇400、殼聚糖。

3 結論

本文首次從畫眉草中提取分離出了3種多糖TPS1、TPS2、TPS3，提取率分別為 0.42%、0.66%、0.54%。3種多糖均為小分子多糖，分子量分別為7886 Da、8467 Da、6366 Da。TPS1 單糖組成為果糖，TPS2、TPS3單糖組成為阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、核糖和一種未知糖。

由于畫眉草是一種耐旱性植物，推測其可能有良好的保濕性能，本文著重對分子量較大的多糖TPS2進行了保濕和吸濕性能的初步探究，與常用保濕劑在相對濕度(RH)43%和81%下進行了比較，表明TPS2的保濕和吸濕能力優于常用保濕劑甘油、聚乙二醇400和殼聚糖，是一種優良的保濕劑。

多糖是一種天然高分子多聚物，通常具有抗病毒、抗腫瘤、抗衰老、降血糖、抗過敏等活性，民間有采用傳統的煎煮畫眉草的方法來治療白血病并有一定的效果，畫眉草多糖是一種具有研究價值的天然提取物。后續工作將進一步探討畫眉草多糖的其他應用性能，并對其單糖糖苷鍵的連接方式和特征活性集團進行分析，以開發和利用畫眉草多糖天然提取物。

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