甲胎蛋白及其單核苷酸多態(tài)性與肝細(xì)胞癌易感性的研究

吉 強(qiáng)， 顧 星， 高春芳

(第二軍醫(yī)大學(xué)東方肝膽外科醫(yī)院實驗診斷科，上海 200438)

甲胎蛋白 (alpha-fetoprotein，AFP)于1956年首次被發(fā)現(xiàn)，由Halbrecht等[1]報道其為胎兒發(fā)育早期由肝臟和卵黃囊合成的一種血清糖蛋白。AFP是類白蛋白家族成員蛋白之一，是一種胚胎時期或病理狀態(tài)下合成的蛋白質(zhì)，在生物個體發(fā)育以及肝細(xì)胞癌 (hepatocellular carcinoma，HCC)發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。AFP最初在胚胎時期表達(dá)，出生后逐漸停止表達(dá)，而發(fā)生腫瘤時又開始表達(dá)。這種基因表達(dá)方式是典型的真核生物基因表達(dá)調(diào)控模型，因此，對AFP基因在胚胎肝臟和卵黃囊及腫瘤發(fā)生過程中表達(dá)方式的研究具有重要意義。AFP自發(fā)現(xiàn)后長期以來一直被作為腫瘤尤其是HCC的重要分子標(biāo)志物用于臨床診斷、治療及預(yù)后判斷。然而，對AFP的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)與HCC相關(guān)性的認(rèn)識遠(yuǎn)不如對AFP本身生物學(xué)功能的了解。隨著近年來對AFP SNP研究的深入，發(fā)現(xiàn)其SNP與HCC發(fā)生、發(fā)展也存在著非常密切的關(guān)系。我們擬對AFP的分子結(jié)構(gòu)、生理功能，特別是AFP SNP與HCC相關(guān)性的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

一、AFP的分子結(jié)構(gòu)

AFP是一個胚胎特異的血清α-球蛋白，其基因定位于4號染色體長臂11～12區(qū)，調(diào)控區(qū)包括啟動子(promoter)、沉寂子(silencer)及增強(qiáng)子(enhancer)。AFP的分子結(jié)構(gòu)已經(jīng)比較明確:是1個糖蛋白，含有1個由寡聚糖組成的糖基，相對分子質(zhì)量約為68000，電泳時位于白蛋白和α1-球蛋白之間，半衰期為5 d[2]。AFP與維生素D結(jié)合蛋白、α-白蛋白和血清白蛋白同屬類白蛋白家族。AFP可結(jié)合和轉(zhuǎn)運大量血清配基，包括膽紅素、脂肪酸、視磺酸、類固醇、染料、重金屬和各種藥物等，也與糖代謝、細(xì)胞骨架構(gòu)成或移位有關(guān)[3]。

二、AFP的生理病理變化及臨床應(yīng)用

AFP的生物學(xué)功能非常錯綜復(fù)雜，最早報道其在人類妊娠和癌癥中的生物學(xué)活性是在上世紀(jì)80年代中后期。在胚胎發(fā)育過程中，AFP的增強(qiáng)子始終處于激活態(tài)，而沉寂子處于抑制狀態(tài)，因此，增強(qiáng)子的信號可以順利到達(dá)啟動子從而啟動AFP基因大量表達(dá)。胎兒出生后，沉寂子活化，阻礙了增強(qiáng)子的啟動效應(yīng)，使AFP表達(dá)受到抑制。但是當(dāng)HCC發(fā)生時，沉寂子再次受到抑制，使得AFP基因轉(zhuǎn)錄又一次激活并大量表達(dá)。隨著上世紀(jì)90年代以后AFP在胎兒和腫瘤生長中的生理學(xué)作用得到進(jìn)一步的證實，使得AFP在人類疾病診斷和治療中開始發(fā)揮重要作用[4]。

AFP是胎兒血循環(huán)中的主要蛋白，結(jié)合及運輸配體的功能被作為胎兒發(fā)育期間一個重要功能，主要與雌激素結(jié)合抑制母體對胎兒的免疫排斥反應(yīng)，并對胎兒生長發(fā)育起調(diào)節(jié)作用。一般婦女妊娠3個月后，AFP開始高，其數(shù)值持續(xù)升高至孕30周左右達(dá)峰值，此后逐漸下降，分娩后1年內(nèi)恢復(fù)正常。胎兒出生后血清中的AFP含量很快下降，8個月時AFP降至成年人水平，一般波動在1～5 ng/mL。AFP作為一個腫瘤相關(guān)的胚胎蛋白長期以來被作為檢測胎兒缺陷或腫瘤發(fā)生的一個血清標(biāo)志物，自從AFP應(yīng)用于臨床后，HCC術(shù)前確診率明顯提高[5]。AFP在正常成人血清幾乎檢測不到或極其微量，而在成人HCC患者中大約70% ～85%都有AFP異常表達(dá)[6]，此外有研究把AFP作為癌癥預(yù)后不良的預(yù)示指標(biāo)[7]。血清AFP水平的明顯和持續(xù)升高與HCC的大小和惡性程度也密切相關(guān)，并且提示預(yù)后不良[8-9]。

由于AFP與HCC的發(fā)生和高死亡率密切相關(guān)，其生理及病理學(xué)作用近年來引起了廣泛的關(guān)注[10-11]。在過去的十幾年中，對AFP功能的研究已經(jīng)取得了引人注目的進(jìn)展。有體外研究表明，AFP可能通過其受體參與到多種細(xì)胞進(jìn)程中，如細(xì)胞分化、生長、凋亡，細(xì)胞因子的產(chǎn)生，免疫抑制及腫瘤發(fā)生等方面[12]。由于分泌到循環(huán)系統(tǒng)的AFP能促進(jìn)細(xì)胞生長，因此，其被定義為個體發(fā)育和腫瘤生長調(diào)控因子[4]。另外，AFP對多種腫瘤細(xì)胞還有雙重調(diào)節(jié)生長的作用[13]。十多年前就有學(xué)者對其展開了體外研究[14]，用不同種類的腫瘤細(xì)胞和正常人胚胎成纖維細(xì)胞作為研究對象，發(fā)現(xiàn)劑量＞100 mg/L的AFP作用于體外培養(yǎng)的各種細(xì)胞，均有不同程度的生長抑制作用，但若劑量＜100 mg/L時，其對細(xì)胞的生長有明顯促進(jìn)作用。作為一個生長調(diào)節(jié)因子可雙重調(diào)節(jié)生長，并具有劑量依賴性，這種生長調(diào)節(jié)作用可能是通過凋亡調(diào)節(jié)、胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控以及使受體敏感性下降等方式實現(xiàn)，但其具體機(jī)制尚不清楚。

三、AFP的SNP與HCC相關(guān)性研究現(xiàn)狀

HCC的發(fā)生是一個多因素復(fù)雜的生物學(xué)過程，在其發(fā)生、發(fā)展機(jī)制的研究中，個體是否患HCC在一定程度上取決于個體的遺傳易感性，因此對宿主遺傳易感性的研究越來越受到重視。對HCC患者及其親屬的研究表明，遺傳因素對HCC的發(fā)病具有一定的影響，在HCC的病因中，遺傳因素約占整個危險因素的五分之三[15]。

SNP作為第3代分子遺傳標(biāo)記，具有數(shù)量多、分布廣及高度穩(wěn)定性等特點，許多遺傳疾病和腫瘤都與基因序列中的突變密切相關(guān)，充分反映了個體間的遺傳差異，已成為目前HCC遺傳易感性研究的熱點[16]。SNP是基因組水平上由單個核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性，在人群中的發(fā)生頻率＞1%，人類染色體上平均每1000個堿基對中就會出現(xiàn)1個SNP，人類基因組中大約存在300萬個SNP位點。根據(jù)其在基因中的位置，SNP可分為基因編碼區(qū)SNP(coding SNP，cSNP)和基因調(diào)控區(qū)SNP(regulatory SNP，rSNP)。由于HCC發(fā)生具有顯著的地區(qū)性差異，西方國家發(fā)病率相對較低，有關(guān)SNP與HCC關(guān)系的研究報道主要來自東南亞。SNP作為反映個體遺傳易感性差異的重要方面，在某一惡性腫瘤人群和正常對照人群中進(jìn)行SNP對比分析，可以確定SNP位點和/或其鄰近變異與腫瘤發(fā)生風(fēng)險的關(guān)系。

近年來，與HCC相關(guān)的SNP研究因技術(shù)的進(jìn)步而更為寬泛，HCC某些特定的SNP可以通過改變基因的功能和表達(dá)影響個體對HCC的易感性，具體可能在多種途徑發(fā)揮作用，能夠影響HCC發(fā)病風(fēng)險的SNP位點已有很多相關(guān)報道[17]，但其中AFP的SNP與HCC易感性相關(guān)研究相對較少，由于AFP的表達(dá)水平與HCC有重要關(guān)聯(lián)，所以AFP的SNP與HCC易感性相關(guān)研究多集中在AFP基因表達(dá)啟動調(diào)控區(qū)域。其中較早 Toyota等[18]使用限制性片段長度多態(tài)性(restriction frangment length polymorphism，RFLP)標(biāo)記DNA技術(shù)發(fā)現(xiàn)在25個日本患者c-DNA克隆中存在多態(tài)性。接著Igarashi等[19]報道從4例患者的配對HCC組織、癌旁組織、肝纖維化組織及外周血白細(xì)胞研究中發(fā)現(xiàn)，其中近AFP基因啟動子區(qū)域的2個位點多態(tài)性與HCC中AFP的再次表達(dá)無關(guān)，但同時也提示AFP基因存在基因多態(tài)性的現(xiàn)象。隨著新的檢測方法出現(xiàn)和SNP概念的明確，Chen等[20]在對 AFP的 SNP進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其啟動子區(qū)域-330、-401和-6923個位點的多態(tài)性造成AFP血清表達(dá)水平的顯著改變，并且-692位點多態(tài)性與HCC易感性具有相關(guān)性。而近期Suriapranata等[21]研究了印度尼西亞人群中AFP基因上47個SNP位點后，發(fā)現(xiàn)有6個SNP位點與HCC及肝纖維化相關(guān)，包括1個位于基因啟動子區(qū)域 (rs6834059)、4個位于第1內(nèi)含子區(qū) 域 (rs3796678、rs3796677、rs3796676 和rs28532518)和1個位于第2內(nèi)含子區(qū)域(rs4646038)，其中 rs6834059位點多態(tài)性中 GG基因型與HCC和肝纖維化的低發(fā)生率有顯著相關(guān)性[比值比(OR)=0.167，P=0.0025 和 OR=0.181，P=0.0026]，而 rs3796678 位點多態(tài)性中AA基因型，rs3796677、rs3796676和 rs28532518位點多態(tài)性中TT基因型，rs4646038位點多態(tài)性中GA基因型與HCC有顯著的相關(guān)性 (OR=6.240，P=0.0005;OR=8.18，P=0.0001;OR=5.32，P=0.0005;OR=6.26，P=0.0002 和 OR=2.26，P=0.0122)。此外，在研究了印度尼西亞人群不同基因型與AFP表達(dá)水平相關(guān)性后，發(fā)現(xiàn)在HCC和肝纖維化病例組都存在rs6834059位點GG基因型攜帶者血清AFP表達(dá)水平明顯低于CC和CG基因型攜帶者(GG與CC型比較:P=0.028，P=0.082;GG 與 CG 型比較:P=0.011，P=0.017)，這也同該基因型與疾病相關(guān)性結(jié)果相吻合。并且進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)2個位于第7內(nèi)含子和3'UTR區(qū)域的SNP位點 (rs2298839和rs10020432)與肝纖維化易感性相關(guān)，從而提示AFP基因的遺傳變異與印度尼西亞人群HCC和肝纖維化具有相關(guān)性。

四、展望

AFP是HCC發(fā)生、發(fā)展過程中特異表達(dá)的蛋白，多年來的研究表明，其具有復(fù)雜的生物學(xué)功能。AFP作為HCC的血清標(biāo)志物用于臨床已有幾十年的歷史，迄今為止，仍是特異性和敏感性最好的HCC診斷指標(biāo)，廣泛應(yīng)用于HCC的篩查、早期診斷、預(yù)后評價、療效觀察、術(shù)后隨訪監(jiān)測等。近年來，通過對其功能的深入研究，發(fā)現(xiàn)AFP并非只是一種在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的伴隨蛋白分子，其在HCC細(xì)胞的生長、增殖及凋亡等過程中發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用。除了胞外的配體結(jié)合和運輸功能，以及作為生長調(diào)控因子刺激腫瘤細(xì)胞生長外，細(xì)胞內(nèi)的AFP還可以通過與轉(zhuǎn)錄因子或一些關(guān)鍵蛋白之間發(fā)生相互作用而作為信號分子參與對下游基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控或?qū)π盘柾樊a(chǎn)生影響。這些為我們研究AFP在腫瘤的癌變及化療中的影響機(jī)制提供了新的思路。此外，在某些病理情況下AFP基因表達(dá)的再次啟動，是否與胎肝發(fā)育時期的表達(dá)具有相關(guān)性還有待于進(jìn)一步探討，以期為HCC的治療提供實驗及理論的基礎(chǔ)。

[1]Halbrecht I，Klibanski C.Identification of a new normal embryonic haemoglobin[J]. Nature，1956，178(4537):794-795.

[2]Abelev GI，Lazarevich NL.Alpha-fetoprotein(AFP):solved and unsolved problems[J].McGill J Med，1996，2(2):127-134.

[3]常彬霞，辛紹杰.甲胎蛋白及其臨床應(yīng)用研究進(jìn)展[J].世界華人消化雜志，2010，18(6):576-580.

[4]Mizejewski GJ.Therapeutic use of human alpha-fetoprotein in clinical patients:is a cancer risk involved[J].Int J Cancer，2011，128(1):239-242.

[5]Leerapun A，Suravarapu SV，Bida JP，et al.The utility of Lens culinaris agglutinin-reactive alpha-fetoprotein in the diagnosis of hepatocellular carcinoma:evaluation in a United States referral population[J].Clin Gastroenterol Hepatol，2007，5(3):394-402.

[6]Butterfield LH，Ribas A，Dissette VB，et al.A phaseⅠ/Ⅱ trial testing immunization of hepatocellular carcinoma patients with dendritic cells pulsed with four alpha-fetoprotein peptides[J].Clin Cancer Res，2006，12(9):2817-2825.

[7]Schmidt LE，Dalhoff K.Alpha-fetoprotein is a predictor of outcome in acetaminophen-induced liver injury[J].Hepatology，2005，41(1):26-31.

[8]Tangkijvanich P，Anukulkarnkusol N，Suwangool P，et al.Clinical characteristics and prognosis of hepatocellular carcinoma:analysis based on serumalpha-fetoprotein levels[J].J Clin Gastroenterol，2000，31(4):302-308.

[9]徐蓉生.腫瘤標(biāo)志物在消化道腫瘤中的應(yīng)用范圍及臨床意義[J].腫瘤預(yù)防與治療，2008，21(3):334-337.

[10]Mizejewski GJ.Alpha-fetoprotein(AFP)-derived peptides as epitopes for hepatoma immunotherapy:a commentary[J]. Cancer Immunol Immunother，2009，58(2):159-170.

[11]Muehlemann M，Miller KD，Dauphinee M，et al.Review of growth inhibitory peptide as a biotherapeutic agent for tumor growth，adhesion，and metastasis[J].Cancer Metastasis Rev，2005，24(3):441-467.

[12]Wang XW，Xie H.Alpha-fetoprotein enhances the proliferation of human hepatoma cells in vitro[J].Life Sci，1999，64(1):17-23.

[13]李國欽.甲胎蛋白的研究進(jìn)展[J].中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志，2008，18(6):381-383.

[14]Dudich E，Semenkova L，Gorbatova E，et al.Growthregulative activity of human alpha-fetoprotein for different types of tumor and normal cells[J].Tumour Biol，1998，19(1):30-40.

[15]米登海，羅好曾，陳學(xué)鵬，等.肝癌遺傳模式與危險因素病例-對照研究[J].中國公共衛(wèi)生，2006，22(7):849-850.

[16]孫樹漢，楊勝利.單核苷酸多態(tài)性與復(fù)雜性狀疾病[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2004，25(2):117-119.

[17]顧 星，高春芳.單核苷酸多態(tài)性與原發(fā)性肝細(xì)胞癌易感性的研究進(jìn)展[J].中華肝臟病雜志，2010，18(3):235-237.

[18]Toyota M，Hinoda Y，Nakano T，et al.A new restriction fragment length polymorphism of the human alphafetoprotein gene in Japanese individuals:detection of loss of heterozygosity in human hepatocellular carcinoma[J].Tumour Biol，1992，13(3):133-137.

[19]Igarashi K，Aoyagi Y，Ohkoshi S，et al.Sequence analysis of the proximal promoter region of the human alpha-fetoprotein gene in hepatocellular carcinoma[J].Cancer Lett，1994，76(2-3):93-99.

[20]Chen GG，Ho RL，Wong J，et al.Single nucleotide polymorphism in the promoter region of human alphafetoprotein(AFP)gene and its significance in hepatocellular carcinoma(HCC)[J].Eur J Surg Oncol，2007，33(7):882-886.

[21]Suriapranata IM，Sudania WM，Tjong WY，et al.Alpha-fetoprotein gene polymorphisms and risk of HCC and cirrhosis[J].Clin Chim Acta，2010，411(5-6):351-358.