質粒介導aac(6')-Ib基因檢測與喹諾酮類耐藥

趙 倩， 汪雅萍，應春妹， 鄭 冰，張灝旻， 楊 俊

(上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院檢驗科，上海 200127)

大腸埃希菌是我國泌尿生殖系感染最為常見的病原菌[1]，臨床治療常選喹諾酮類抗菌藥物[2]，在抗菌藥物選擇壓力下，大腸埃希菌對喹諾酮類抗菌藥物耐藥率逐年升高。喹諾酮類藥物耐藥機制復雜，主要由靶位改變和主動外排兩個機制所致，這兩者均由染色體突變引起[3-4]。21世紀初期質粒介導喹諾酮耐藥(PMQR)機制被關注，其中喹諾酮類修飾酶基因aac(6')-Ib基因變異體(cr)可引起低水平的PMQR[5]。由于質粒具有接合、轉移等多種特性，以此為載體可引起水平傳播的耐藥基因給人類帶來很大危害，因此，研究價值重大。本實驗了解上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院大腸埃希菌對喹諾酮類抗菌藥物耐藥情況并分析質粒介導aac(6')-Ib基因存在與喹諾酮類藥物耐藥性的關系。

材料和方法

一、材料

1.菌株來源 收集上海仁濟醫院2010年3月至2011年3月臨床中段尿分離大腸埃希菌121株，其中環丙沙星敏感株27株，耐藥株94株;質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922。

2.培養基 血平板為上海伊華生物科技有限公司產品。MH平板為法國生物梅里埃公司產品。

3.抗菌藥物紙片 阿米卡星、慶大霉素、氨芐西林、氨芐西林-舒巴坦、哌拉西林、頭孢唑啉、頭孢克洛、頭孢呋辛、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢美唑、哌拉西林-他唑巴坦、亞胺培南、美洛培南、厄他培南、萘啶酸、環丙沙星、諾氟沙星、左氧氟沙星、復方磺胺甲口惡唑為英國OXOID公司產品。

4.試劑及儀器 離心柱型-質粒小提試劑盒購于北京天根生化科技有限公司，聚合酶鏈反應(PCR)擴增及產物電泳相關試劑均購于大連寶生物工程有限公司。PCR引物購于上海英濰捷基貿易有限公司，aac(6')-Ib基因引物序列參照文獻[5]，見表1。Phoenix-100全自動微生物鑒定儀為美國BD公司產品，Tanon-2500凝膠成像系統為上海天能科技有限公司產品。

表1 aac(6')-Ib基因的PCR引物序列

二、方法

1.菌株鑒定及藥敏試驗 Phoenix-100全自動微生物鑒定/藥敏系統:按儀器說明書操作。所有菌株均嚴格按2009年美國臨床實驗室標準化協會(CLSI)的紙片擴散法(K-B)對21種抗菌藥物的耐藥性檢測并判讀結果。

2.基因組DNA制備 離心柱型-質粒小提試劑盒(編號:DP103-02)按產品說明書操作。

3.PCR擴增 總反應體系為50 μL，其中10× PCR 緩沖液 (25mM)5 μL，dNTP(10mM)4 μL，上游引物(50pM)和下游引物(50pM)各2 μL，DNA 模板 4 μL，Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)0.3 μL，Sterial dd H2O 32.7 μL。aac(6')-Ib 基因PCR反應擴增條件:94℃ 5 min預變性;循環變性94 ℃ 30 s，復性55℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，共30個循環;最后72℃延伸5 min。

4.瓊脂糖凝膠電泳 取10 μL PCR產物混合2 μL溴酚藍，1.2%的瓊脂糖凝膠(含溴乙錠)電泳，電壓恒定為150V，30 min，在紫外燈下觀察結果。如果出現明顯的482bp亮帶即為aac(6')-Ib基因陽性。

5.DNA測序并確定基因型 將所有 aac(6')-Ib基因陽性株的PCR擴增產物送北京六合華大基因科技股份有限公司進行測序。DNA序列利用 NCBI網站(www.ncbi.nlm.nih.gov/)的Blastn程序進行比對確定基因型。

三、統計學方法

采用WHONET5.4軟件及 SPSS11.0軟件進行統計分析。P＜0.05表示差異有統計學意義。

結 果

一、121株大腸埃希菌耐藥性檢測結果

121株大腸埃希菌臨床分離株對厄他培南、亞胺培南、美洛培南3種碳青霉烯類抗菌藥物未產生耐藥;對頭孢美唑、哌拉西林-他唑巴坦、阿米卡星耐藥率較低，分別為3.3%、14.0%和16.7%;對其他抗菌藥物耐藥率均高(＞55%);對4種喹諾酮類抗菌藥物耐藥率均高于75.0%，特別是第一代藥物萘啶酸耐藥率為91.7%，且只要菌株對喹諾酮類抗菌藥物耐藥抑菌圈皆為6 mm。對左氧氟沙星敏感率為17.4%明顯高于環丙沙星為9.9%，略高于諾氟沙星為14.9%，這可能與環丙沙星作為喹諾酮類代表性藥物更常被臨床應用以及左氧氟沙星具有優越的體外抗菌活性有關，與文獻報道基本相符[6]。

二、大腸埃希菌aac(6')-Ib基因陽性與陰性菌株的耐藥性比較結果

大腸埃希菌aac(6')-Ib陽性與陰性菌株的耐藥性比較結果見表2。環丙沙星敏感株中未檢測aac(6')-Ib基因。

表2 大腸埃希菌aac(6')-Ib基因陽性與基因陰性菌株的耐藥性比較 (%)

三、aac(6')-Ib基因PCR擴增及擴增產物測序結果

121株大腸埃希菌中17株擴增出482bp aac(6')-Ib片段，陽性率為14.0%(17/121)。部分菌株的擴增產物電泳條帶見圖1。瓊脂糖凝膠電泳均呈單一條帶，且與目的片段大小相符。對所有17株aac(6')-Ib陽性菌株擴增產物進行測序，結果14株在aac(6')-Ib的第223位均出現點突變T→A，即攜帶aac(6')-Ib-cr[Trp→Arg(色氨酸→精氨酸)]，突變率為 82.4%(14/17)，經與 NCBI Genebank中aac(6')-Ib-cr基因變異體(cr)比對吻合率為99%(注冊號:FJ949571.1);3株菌未發生突變，DNA序列與Genbank中的aac(6')-Ib基因(注冊號:HM569733.1)比對吻合率為99%。

圖1 部分菌株aac(6')-Ib基因PCR電泳結果

討 論

喹諾酮類抗菌藥物產生耐藥的機制復雜，1998年以前人們一直認為喹諾酮類耐藥是由細菌拓撲異構酶基因或/和調節外排泵表達的基因發生染色體突變所致[7-8]。近年來質粒介導PMQR機制備受關注，qnr基因和aac(6')-Ib基因cr等相繼被發現。朱東安等[9]發現1株同時具有質粒介導的喹諾酮類耐藥基因qnr S和CTX-M-3型超廣譜β-內酰胺酶的福氏志賀菌。汪雅萍等[10]報道志賀菌若攜帶qnr基因可使喹諾酮類抗菌藥物的敏感性降低。Robicsek等[11]報道aac(6')-Ib基因cr是氨基糖苷乙酰轉移酶變異體基因，能修飾滅活氨基糖苷類和喹諾酮類2大類化學母體結構各異藥物，并且能提高暴露于環丙沙星的菌株發生染色體突變的幾率。研究表明，aac(6')-Ib基因cr于223位、454位發生2個堿基突變可致表達蛋白2處氨基酸位點改變，最終蛋白產物為一類氨基糖苷類乙酰轉移酶，該類酶通過對含哌嗪胺為底物的喹諾酮類藥物環丙沙星及諾氟沙星脫乙酰化作用致使藥物敏感性降低。aac(6')-Ib基因cr在太平洋地區大腸埃希菌中檢出率最高[5]。

本研究中，aac(6')-Ib基因檢出17株，大腸埃希菌對喹諾酮類抗菌藥物敏感菌株中未檢測出aac(6')-Ib基因。對17株aac(6')-Ib基因陽性株PCR擴增產物進行測序，其中14株為 aac(6')-Ib基因cr，其余3株未發生突變。突變株與未突變株對21種抗菌藥物的耐藥率比較差異無統計學意義(P＞0.05)，可能檢出菌株偏少影響統計。我們對大腸埃希菌aac(6')-Ib基因陽性與陰性菌株的耐藥性進行比較可見陽性株對阿米卡星耐藥率高于陰性株且差異有統計學意義(P＜0.01);未見慶大霉素的差異與文獻報道稍有不同[5]，可能與質粒介導低水平耐藥有關;但我們的研究可見在β-內酰胺酶抑制劑藥物(氨芐西林-舒巴坦和哌拉西林-他唑巴坦)和頭孢菌素類藥物(頭孢唑啉、頭孢克洛和頭孢呋辛)間陽性株耐藥率高于陰性株且差異有統計學意義(P＜0.05);特別是以易遭aac(6')-Ib變異體酶乙酰化的哌嗪胺為底物的氟喹諾酮類藥物(環丙沙星和諾氟沙星)間存在陽性株耐藥率高于陰性株且差異有統計學意義(P ＜0.05)[8];至于左氧氟沙星的差異可能與aac(6')-Ib基因cr存在會大大增加環丙沙星染色體選擇突變有關[5]，染色體突變的同時也引起左氧氟沙星耐藥，這有待于進一步研究。

另外，我們已知aac(6')-Ib基因cr可同時導致氨基糖甙類和喹諾酮類兩種藥物失活，而且還能提高暴露于環丙沙星的菌株發生染色體突變的幾率，由本次實驗數據可見:大腸埃希菌對喹諾酮類抗菌藥物耐藥菌株抑菌圈皆為6mm是高水平耐藥，更似染色體基因已發生突變造成的耐藥，這種推測有待進一步證實。

質粒介導 aac(6')-Ib基因 cr通過參與PMQR機制僅介導低水平的喹諾酮耐藥，但其給臨床帶來的危害嚴重。其一，PMQR機制易在喹諾酮藥物的選擇壓力下選擇出染色體突變株，引起更高水平的喹諾酮類耐藥產生。其二，aac(6')-Ib基因cr依借質粒載體可引起多宿主間的廣泛傳播。其三，質粒通常具有捕捉耐藥基因的特性，易造成菌株的多重耐藥性。盡管aac(6')-Ib基因cr于21世紀才被關注，但在中國上海自2000年至2001年間其就已經存在于過半的多重耐藥大腸埃希菌分離株中[5]。因此，廣大醫務工作者應重視細菌的耐藥問題，合理使用抗菌藥物，為及時有效預防和控制院內感染發生，減少多重耐藥細菌產生出一份力。

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