實時熒光定量PCR快速診斷肺炎鏈球菌

顏善活，孫 雷，符可鵬，卓永光，楊善業，樊祖茜，黃永霞

(廣西壯族自治區欽州市婦幼保健院，廣西 欽州 535000)

肺炎鏈球菌是一種可引發肺炎、腦膜炎、菌血癥、中耳炎及鼻竇炎等疾病的細菌[1]。各個年齡段人群都可能受感染，而2歲以下的幼兒最容易罹患，如果沒有得到及時的診斷和治療，患者可能會失聰、智障、癱瘓、延遲會話能力，甚至死亡[2]。目前，臨床對社區獲得性肺炎患者診斷的金標準是通過細菌培養的檢測方法來確定病原菌，該方法雖然能對部分病例進行診斷和確診，但在臨床應用中仍存在許多不足[3]。近年來逐漸發展起來的實時熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)為肺炎鏈球菌提供了快速而敏感的診斷方法，解決了傳統方法的不足，相比細菌培養法其具有無需進行細菌培養、不受藥物影響、3～5 h內即可完成診斷等特點，不僅能快速對肺炎鏈球菌感染進行診斷，更重要的是能及時控制病情的發展。本研究中，為了驗證引物及探針的敏感性和特異性，分別利用肺炎鏈球菌自溶素(Lyt)和溶血素(Ply)的基因引物及探針對肺炎鏈球菌、非肺炎鏈球菌、不同濃度梯度的肺炎鏈球菌以及臨床標本進行熒光定量PCR。同時，對實時熒光定量PCR擴增產物的量與培養陽性的相關性進行了初步探討。

材料和方法

一、材料

1.標本來源 標本來源于2010年4月至2011年12月欽州市婦幼保健院臨床分離的非重復的肺炎鏈球菌、經過鑒定的非肺炎鏈球菌以及臨床送檢的痰標本。

2.主要儀器和試劑 熒光定量PCR儀為達安基因公司DA7600產品，紫外分光光度計、高速離心機、電泳儀等購自美國Labnet公司，電泳凝膠成像分析系統購自美國BIO-RAD公司，熒光定量PCR系列試劑購自天根生化科技(北京)有限公司。

3.PCR引物及Taqman探針的設計與合成經參考有關文獻和檢索GenBank，分別以肺炎鏈球菌的lyt和ply基因為目的序列合成引物及探針。ply基因[4]引物序列為:forward 5'-TGCAGAGCGTCCTTTGGTCTAT-3'，reverse 5'-CTCTTACTCGTGGTTTCCAACTTGA-3';ply基因探針為:probe FAM-5'-TGGCGCCCATAAGCAACACTC GAA-3'-TAMRA，lytA 基因[5]引物序列為:forward 5'-ACGCAATCTAGCAGATGAAGC-3'，reverse 5'-TGTTTGGTTGGTTATTCGTGC-3'，lytA基因探針為:probe FAM-5'-TTTGCCGAAAACGCTTGATACAGGG-3'-TAMRA，引物及探針均由金斯瑞生物科技有限公司合成。

二、方法

1.肺炎鏈球菌的培養及鑒定 取臨床痰液標本和標準菌株肺炎鏈球菌(ATCC 49619)，分別接種于哥倫比亞血瓊脂培養基上，置于5%的二氧化碳培養箱中，在37℃條件下培養18～24 h。采用革蘭染色鏡檢、奧普托欣(optochin)和膽汁溶解試驗鑒定。

2.臨床痰液標本及培養后的菌株DNA的提取 取接種剩余的痰標本1 mL于1.5 mL離心管中或挑取純培養的菌株懸浮于1 mL無菌生理鹽水中，15000×g離心5 min，棄上清。在沉淀中加入裂解液100～150 μL，然后100℃水浴10 min，10000×g離心10 min，上清液作為模板DNA。

3.實時熒光定量PCR 以上述方法提取經過培養和鑒定后的10株肺炎鏈球菌DNA，分別以其DNA為模板進行實時熒光定量PCR，25 μL反應體系:引物 1 μL，模板 2 μL，去離子水 9.5 μL，實時熒光定量 PCR mix 12.5 μL。擴增條件為:93℃預變性3 min;93℃變性30 min，60℃ 1 min，共42個循環，記錄試驗結果并保存擴增曲線。

4.特異性試驗 對通過培養并鑒定后的腦膜炎奈瑟菌、流感嗜血桿菌、乳糖奈瑟菌、副流感嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、糞腸球菌、大腸埃希菌、假單胞菌、無乳鏈球菌、釀膿鏈球菌、卡他布蘭漢菌以及人類細胞組織分別提取DNA，進行實時熒光定量PCR檢測，同時以標準菌株肺炎鏈球菌(ATCC 49619)作為陽性對照，無菌蒸餾水作為空白對照。

5.敏感性試驗 用棉簽刮取培養基上的純菌苔，按照天根DNA試劑盒中的操作說明提取菌體染色體DNA，可直接用作PCR模板或置－20℃保存備用。用紫外分光光度計測得參考菌株DNA濃度并調整至10 ng/μL，用超純水10倍系列稀釋，使其終濃度為 1 ng、100 pg、10 pg、1 pg、100 fg，稀釋好的DNA需立即進行實時熒光定量PCR檢測，并以無菌蒸餾水作為空白對照。

6.臨床標本的實時熒光定量PCR檢測 采用實時熒光定量PCR和傳統的細菌培養法同時檢測200例臨床痰液標本。每次擴增均以標準菌株肺炎鏈球菌(ATCC 49619)全基因組DNA為陽性對照，超純水為陰性對照;所有相同的標本和陰陽性對照都設有兩孔以進行平行檢測。

三、統計學方法

應用SPSS 16.0統計軟件進行 χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、實時熒光定量PCR擴增結果

利用肺炎鏈球菌的lyt與ply基因為目的序列設計的引物及Taqman探針，分別對10株經過培養及鑒定的肺炎鏈球菌進行檢測，結果顯示10株肺炎鏈球菌均獲得了明顯的擴增信號，表明合成的引物及Taqman探針均能有效的擴增并檢測出肺炎鏈球菌的lyt基因及ply基因。見圖1(a)、圖1(b)。

二、特異性試驗

利用引物及Taqman探針分別對經分離的12株非肺炎鏈球菌以及1例人類細胞組織DNA進行熒光定量PCR檢測，結果顯示除了肺炎鏈球菌的陽性對照DNA顯示為陽性外，其他細菌均無明顯的擴增信號，表明所合成的引物及Taqman探針對肺炎鏈球菌的lyt基因及ply基因具有高度的特異性。見圖1(c)、圖1(d)。

三、敏感性試驗

分別選取菌懸液濃度為1 ng、100 pg、10 pg、1 pg、100 fg的肺炎鏈球菌DNA進行定量PCR檢測，ply基因與lyt基因的引物與探針的熒光定量PCR結果顯示，各個濃度的肺炎鏈球菌DNA均具有明顯的擴增信號，其檢測的最低肺炎鏈球菌DNA濃度可低至100 fg。見圖2。

圖1 ply及lyt基因引物與探針的特異性試驗

圖2 ply和lyt基因引物與探針的敏感性試驗

四、臨床標本檢測結果

利用實時熒光定量PCR和細菌培養法同時檢測200例臨床標本，熒光定量PCR檢測的肺炎鏈球菌陽性標本42例(陽性率為21%)，而培養法陽性16例(陽性率為8%)，2種方法比較差異有統計學意義(P＜0.05)。ply及lyt基因的不同擴增次方量下細菌培養陽性的結果見表1，培養陽性的臨床標本在熒光定量PCR檢測中均為陽性，而傳統的細菌培養法只能檢測部分熒光定量PCR擴增量在6次方以上的臨床標本。結果表明，實時熒光定量PCR相比傳統細菌培養法能更快速、特異、敏感地進行肺炎鏈球菌的檢測。

表1 細菌培養和實時熒光定量PCR不同擴增次方的陽性標本量的統計

討 論

目前，細菌培養法診斷肺炎鏈球菌在臨床應用中存在許多不足，近年來逐漸發展起來的分子生物學方法為肺炎鏈球菌的檢測提供了新的方法[6-8]，而實時熒光定量 PCR因其具有快速、準確、特異性高、重復性好等特點，目前已廣泛用于基因表達和病原體檢測等諸多領域。本研究通過利用合成的引物及Taqman探針對肺炎鏈球菌、非肺炎鏈球菌、不同濃度梯度的標準菌株以及臨床標本進行實時熒光定量PCR，結果顯示其不僅能特異、敏感的擴增并鑒定分離的肺炎鏈球菌菌株，而且還能直接應用于臨床標本的檢測。

肺炎鏈球菌的lyt基因與ply基因均為常用的靶基因應用于肺炎鏈球菌種屬的鑒定。lyt基因是肺炎鏈球菌的致病因子之一，對肺炎鏈球菌lyt基因測序顯示，肺炎鏈球菌種內各血清型的lyt基因序列高度保守，且與其他種的鏈球菌存在較大差異[9]。ply基因是肺炎鏈球菌的 ply基因，Carvalho 等[10]分別以 lyt、ply及 psaA 基因為目的基因設計引物和探針，并通過熒光定量PCR檢測肺炎鏈球菌對比其敏感性和特異性，其結果顯示lyt和psaA基因的特異性相對較高，而ply基因的引物和探針除了肺炎鏈球菌外，還能夠擴增出假肺炎鏈球菌。為了避免ply基因擴增中出現非特異性擴增，同時為了調查假肺炎鏈球菌的流行及分布情況，我們采用雙重檢測的試驗，對分析鑒定的原始菌液DNA標本和臨床送檢標本的DNA分別利用所合成的lyt及ply基因引物和探針進行熒光定量PCR，結果lyt及ply基因引物和探針均能進行特異性的擴增，試驗中未出現擴增結果不一致的現象。在后續試驗中，我們將加大擴增標本的量，鑒定并分離出假肺炎鏈球菌，以檢測肺炎鏈球菌及假肺炎鏈球菌的流行情況。

利用實時熒光定量PCR和細菌培養法同時檢測200例臨床標本，實時熒光定量PCR檢測出42例肺炎鏈球菌陽性(陽性率為21%)，而培養法陽性標本為16例(陽性率為8%)，2種方法比較差異有統計學意義。其中有26例實時熒光定量PCR陽性而細菌培養法陰性標本，其原因可能為:采集標本的肺炎鏈球菌的量較少，在與其他細菌競爭中生長被抑制，從而導致結果陰性;也可能是患者采樣前使用過一些抗菌藥物從而導致培養陰性。

在試驗中，培養陽性的臨床標本在熒光定量PCR檢測中均為陽性，并且其擴增量都在6次方以上，因此我們推斷，培養法檢測肺炎鏈球菌的敏感性在100 pg以上。實時熒光定量PCR檢出量可低至100 fg，甚至更低，其敏感性完全達到臨床檢測的要求，當然該方法也適合進行流行病學分析調查。

本研究利用肺炎鏈球菌的lyt和ply基因為目的序列設計并合成的引物和Taqman探針應用于肺炎鏈球菌的檢測，具有敏感性高、特異性強、藥物影響小、檢測速度快、人力花費少、經濟實惠等特點，為臨床肺炎鏈球菌的檢測提供了新的方法。

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