翹鱗肉齒菌多糖的抗氧化活性分析

鄭 義 ，王衛東，孫月娥，朱園園，郭 靜

1徐州工程學院食品(生物)工程學院;2江蘇省食品資源開發與質量安全重點建設實驗室，徐州 221000

翹鱗肉齒菌(Sarcodon aspratus)，屬擔子菌亞門、層菌綱、非褶菌目、齒菌科，子實體似虎掌生長在地上，外表具淺黃褐色茸毛和虎皮紋路，故俗稱黑虎掌菌。卯小嵐［1］在《中國大型真菌》中提到翹鱗肉齒菌子實體中含有較豐富的多糖類物質。子實體還含有豐富的蛋白質、氨基酸、微量元素等營養成分。翹鱗肉齒菌多糖具有一定的藥理作用，通過誘導小鼠脾細胞分泌腫瘤壞死因子-α和NO［2］、刺激小鼠淋巴細胞增殖［3］，而表現出較好的抗腫瘤和免疫調節功能，此外還具有抗病毒、抑菌的作用。目前對翹鱗肉齒菌多糖抗氧化活性的研究鮮見報道。本實驗以翹鱗肉齒菌子實體為研究對象，采用不同體積分數乙醇分級沉淀多糖，分析翹鱗肉齒菌多糖的抗氧化活性，以期為翹鱗肉齒菌多糖開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

TU-1810紫外-可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司;THZ-82恒溫振蕩器，常州國華電器有限公司;標準檢驗篩，浙江上虞華美儀器紗篩廠;風選中藥粉碎機，山東省青州市精誠機械制造有限公司;FA2104N電子分析天平，上海精密科學儀器有限公司;SENCO R201L旋轉蒸發器，上海申生科技有限公司;SIGMA 3K30高速冷凍離心機，Sigma公司。

1.2 材料與試劑

翹鱗肉齒菌購自云南麗江市云麓商貿有限公司;1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，Sigma 公司;其它試劑均為國產分析純。

1.3 翹鱗肉齒菌多糖的提取

將翹鱗肉齒菌用清水洗凈，適當切塊，50℃下干燥，恒重后粉碎，過60目篩，干燥保存待用。稱取翹鱗肉齒菌子實體干粉200 g，加適量水(液料比30 mL/g)，85℃水浴3 h，即得多糖提取液。多糖提取液進行減壓抽濾、濃縮、4℃下醇析、離心、干燥后得沉淀，所得沉淀用體積分數75%乙醇洗滌兩次后，冷凍干燥后得翹鱗肉齒菌粗多糖。翹鱗肉齒菌粗多糖采用Sevag法脫蛋白。然后用自來水透析48 h，蒸餾水透析24 h。透析液濃縮后冷凍干燥得翹鱗肉齒菌多糖。

1.4 翹鱗肉齒菌多糖的乙醇分級沉淀

翹鱗肉齒菌多糖加適量的水復溶，制成多糖水溶液，依次用體積分數為30%、40%、50%、60%、70%的乙醇于4℃冰箱中分級沉淀。冷凍干燥后得翹鱗肉齒菌多糖組分 SAP-1、SAP-2、SAP-3、SAP-4和SAP-5，備用。稱量各組分0.5 g，用蒸餾水配制成20 g/L母液，4℃保存，備用。

1.5 抗氧化活性測定

1.5.1 DPPH自由基清除率測定

DPPH自由基清除率測定參考Wu的方法［4］，將 SAP-1、SAP-2、SAP-3、SAP-4 和 SAP-5 母液用蒸餾水稀釋至不同的質量濃度(0.01～0.25 g/L)，制備成翹鱗肉齒菌多糖樣品溶液。分別移取各樣品溶液樣液1.5 mL，再加入 1.5 mL 含 0.1 mmol/L DPPH的95%乙醇，混合、振蕩，在室溫下避光放置30 min，然后在波長517 nm處檢測吸光度。以Vc作為陽性對照。

清除率計算公式如下:

式中，Ac為對照組吸光值，1.5 mL蒸餾水加1.5 mL含0.1 mmol/L DPPH的95%乙醇;Ai為樣品組吸光值，1.5 mL 樣品液加1.5 mL 含0.1 mmol/L DPPH的95%乙醇;Aj為空白組吸光值，1.5 mL樣品液加1.5 mL 95%乙醇。

1.5.2 還原力測定

還原力測定方法采用Oyaizu［5］報道的方法。量取不同質量濃度(0.01～0.1 g/L)的樣液2 mL，加入0.2 mol/L pH 6.6的磷酸緩沖液2 mL，質量分數為1%(w/w)的鐵氰化鉀［K3Fe(CN)6］溶液2 mL，混勻，50℃水浴下保溫20 min，再加入10%(w/w)的三氯乙酸(TCA)溶液2 mL，震蕩混勻后，以3000 rpm離心10 min。取離心后的上清液2 mL，加入2 mL 去離子水和0.4 mL 0.1%(w/w)的 FeCl3溶液，震蕩混勻后在50℃水浴下保溫10 min，當體系溶液顏色由黃色變為藍色時，在波長700 nm下測定其吸光度值A700，樣品吸光值越大則其還原能力越大。以去離子水代替樣品作為空白對照，Vc作為陽性對照。

1.5.3 羥基自由基清除率測定

羥基自由基清除率測定采用鄰二氮菲比色法［6］。樣品溶液質量濃度為 0.01～10 g/L，以 Vc作為陽性對照。

損傷管:取0.5 mL 0.75 mmol/L 鄰二氮菲的無水乙醇溶液加入1 mL 0.15 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 7.40)和0.5 mL去離子水，充分混勻后加入0.5 mL 0.75 mmol/L 的 FeSO4，混勻后再加入 0.5 mL 0.01%(V/V)的 H2O2，37 ℃水浴60 min 后，536 nm下測其吸光值為A損;未損傷管:以0.5 mL去離子水代替損傷管中的H2O2，重復上述操作步驟，測其吸光值為A未損;樣品管:0.5 mL樣品溶液代替損傷管中的去離子水，測其吸光值為A樣;樣品參比:取1 mL 0.15 mol/L 的磷酸鹽緩沖液(pH 7.40)和0.5 mL樣品溶液混合，加入1.5 mL去離子水，不需水浴，測其吸光值為 A參;空白參比:取1 mL 0.15 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 7.40)加入2 mL去離子水，作為空白調零A空，計算不同樣品對羥基的清除率:

1.5.4 鐵離子螯合能力測定

鐵離子鰲合能力的測定采用 Decker［7］的方法，略有改動。在2 mL不同質量濃度(0.5～20 g/L)的樣品溶液中，加入0.02 mL 5 mmol/L的FeCl2，再加0.2 mL 5 mmol/L Ferrozine，室溫下靜置 10 min，加入等體積的蒸餾水，搖勻，于562 nm下測量吸光度。上述反應體系中，以蒸餾水替代樣品溶液作為空白對照，EDTA作為陽性對照。每個樣品平行測定3次，取其平均值。鐵離子鰲合能力計算公式如下:

式中，A0為空白對照的吸光度;A1為樣品或陽性對照的吸光度。

2 結果與分析

2.1 清除DPPH自由基的能力

DPPH法是評價抗氧化活性的常用方法，抗氧化物質可直接作用于DPPH自由基，使其顏色變淺，根據吸光度的變化可測定物質的抗氧化活性。由圖1可知，在測定的質量濃度范圍，翹鱗肉齒菌各個多糖組分對DPPH自由基的清除能力呈現出劑量依賴性，清除DPPH自由基的能力隨著質量濃度的增大而增大。

質量濃度為0.05 g/L時，翹鱗肉齒菌的5個多糖組分中，SAP-4的清除率最高，為70.02%，SAP-3次之，為61.19%，SAP-1、SAP-2和 SAP-5的清除率分別為55.24%、45.75%和 58.12%。質量濃度為0.1 g/L 時，SAP-4 的清除率為94.97%，SAP-3 的清除率為87.62%，其余組分的清除率均在80%以下。質量濃度為0.2 g/L時，5個組分的清除率均達到90%以上，SAP-4的清除率仍為最高，達94.97%。由此可見，SAP-4具有較強的清除DPPH自由基的能力，其次是SAP-3。當質量濃度低于0.1 g/L時，各個組分對DPPH自由基的清除能力均低于陽性對照Vc;而當質量濃度高于0.1 g/L時，SAP-4的清除率高于Vc。

EC50值是指清除率為50%時的樣品質量濃度，EC50值可作為評價抗氧化能力的重要參數。如某種物質的EC50值低于10 g/L，則表明其具有很好的抗氧化活性［8］。采用Logit回歸可分別計算出各多糖組分及Vc的EC50值(表1)。各多糖組分中，SAP-4的 EC50值最小，為 0.029 g/L，其次是 SAP-3，為0.037 g/L。由EC50值可判斷5個組分對DPPH自由基均具有較強的清除能力，其強弱順序為:SAP-4＞ SAP-3＞ SAP-5＞ SAP-1＞ SAP-2。Vc的EC50值為0.024 g/L，由此表明SAP-4清除DPPH自由基的能力與Vc基本相當。

表1 翹鱗肉齒菌各多糖組分對DPPH自由基清除能力的EC50值Table 1 EC50values of polysaccharides fractions from S.aspratus on DPPH radical scavenging effects

有關真菌多糖清除DPPH自由基能力已有較多報道，劉劍利等［9］對質量濃度均為0.1 g/L的粗提液、醇沉、離子交換和凝膠過濾等四種不同純化階段的香菇菌絲體多糖進行DPPH自由基清除率比較，結果表明四種純化階段的多糖的清除率分別為9.61%、21.33%、43.58% 和 65.06%。由此可見，翹鱗肉齒菌多糖的各個組分對DPPH自由基的清除能力均顯著高于香菇菌絲體多糖，說明翹鱗肉齒菌多糖具有較強的抗氧化活性。

2.2 還原力

抗氧化物質的抗氧化活性與其還原力存在著直接的聯系，還原力越強，抗氧化性越強。由圖2可知，在0.01～0.1 g/L的質量濃度范圍內，翹鱗肉齒菌各多糖組分的還原力隨著濃度的增加而增加，其中SAP-4的還原力最強，當濃度為0.05 g/L時，吸光度為0.603;當濃度為0.1 g/L時，吸光度則達到了1.108。而在0.05 g/L時，陽性對照Vc的吸光度為0.772，濃度為 0.1 g/L 時，吸光度為 1.381。對于分光光度法而言，吸光度高于1.0之后測量結果的相對誤差較大，故不再進一步加大多糖質量濃度。在已測量的質量濃度范圍內，5個多糖組分及Vc的還原能力大小的順序為:Vc＞SAP-4＞SAP-5＞SAP-3＞SAP-1＞SAP-2。

2.3 清除羥基自由基的能力

翹鱗肉齒菌多糖對羥基自由基的清除作用如圖3所示，在0.01～10 g/L的質量濃度范圍內，翹鱗肉齒菌各多糖組分對羥基自由基的清除能力隨質量濃度增大而增大，當質量濃度超過1 g/L后，增幅趨于平緩。測定的質量濃度范圍內，各組分清除羥基自由基的能力均較低，在濃度為5 g/L時，SAP-2和SAP-4的清除率相對較高，分別為 18.92%、18.22%;濃度升高到10 g/L時，各個組分的清除率均未達到 50%，SAP-2和 SAP-4的清除率為26.63%、22.49%。

Chen等［10］通過DEAE-纖維素離子交換柱和瓊脂糖凝膠CL-6B柱從香菇多糖中分離得到3個組分LEPA1、LEPB1和LEPC1，在質量濃度為4 g/L時，3個組分對羥基自由基的清除率分別為74.2%、90.1%和90.6%。由此可見，與香菇多糖相比，翹鱗肉齒菌多糖清除羥基自由基的能力較弱。

2.4 鐵離子螯合能力

鐵離子在生物體內能夠引發脂質過氧化，并導致羥基自由基的產生，因此鐵離子鰲合能力也是一種重要的評價抗氧化能力的指標。Ferrozine能夠定量的與Fe2+結合形成紅色配合物，當有螯合劑(如EDTA、抗氧化物質)存在時，這一過程就會被干擾，導致紅色配合物的生成量減少，一定波長(700 nm)下的吸光度降低，據此可評價抗氧化物質對鐵離子的鰲合能力。翹鱗肉齒菌的5個多糖組分對鐵離子的螯合能力如圖4所示。

在質量濃度為0.5～20 g/L的范圍內，各個組分對鐵離子的螯合能力隨著質量濃度的增大而增大。質量濃度為3 g/L時，SAP-4對鐵離子的螯合能力最大，為69.79%，SAP-5的螯合能力與SAP-4接近，為69.67%;質量濃度為5 g/L時，SAP-4對鐵離子的螯合能力仍然最大，為82.06%，其余組分均未達到80%;質量濃度為10 g/L時，鐵離子螯合能力大小依次為:SAP-4(94.92%)＞SAP-5(83.67%)＞ SAP-3(78.94%)＞ SAP-2(74.23%)＞ SAP-1(69.38%)。質量濃度為20 g/L時，SAP-4螯合率為96.43%，其余組分未達到90%，各組分對鐵離子螯合能力的大小與10 g/L的順序一致。

各多糖組分及陽性對照EDTA對鐵離子螯合能力的EC50值如表2所示。根據EC50值，各組分對鐵離子螯合能力大小依次為SAP-4＞SAP-5＞SAP-2＞SAP-3＞SAP-1，與上述結果基本類似。各組分的EC50值均高于 EDTA(0.281 g/L)，但都低于10 g/L，表明各個組分具有較高的螯合鐵離子的能力。

表2 翹鱗肉齒菌各多糖組分對鐵離子螯合能力的EC50值Table 2 EC50values of polysaccharides fractions from S.aspratus of ferrous ions chelating ability

3 結論

乙醇分級沉淀得到的翹鱗肉齒菌多糖各個組分均表現出較好的抗氧化活性，SAP-4的抗氧化能力最強。在測定的質量濃度范圍，各個組分對DPPH自由基的清除能力均隨質量濃度增大而增大，SAP-4清除DPPH自由基的能力最強，EC50值為0.029 g/L，與陽性對照 Vc基本相當。在0.01～0.1 g/L的質量濃度范圍內，翹鱗肉齒菌各多糖組分的還原力隨著濃度的增加而增加，其中SAP-4的還原力最強，濃度為0.1 g/L時，吸光度為1.108。各組分清除羥基自由基的能力均較低，在質量濃度為10 g/L時，各個組分的清除率均未達到50%。5個多糖組分具有較高的螯合鐵離子能力，SAP-4對鐵離子的螯合能力最強，EC50值為 1.208 g/L。

1 Mao XL(卯小嵐).The Macrofungi in China(中國大型真菌).Zhengzhou:Henan Science and Technology Press，2000:421.

2 Mizuno M，Shiomi Y，Minato K，et al.Fucogalactan isolated from Sarcodon aspratus elicits release of tumor necrosis factor-alpha and nitric oxide from murine macrophages.Int J Immunopharmacol，2000，46:113-121.

3 Han XQ，Chai XY，Jia YM，et al.Structure elucidation and immunological activity of a novel polysaccharide from the fruit bodies of an edible mushroom，Sarcodon aspratus(Berk.)S.Ito.Int J Biol Macromol，2010，47:420-424.

4 Wu HC，Chen HM，Shiau CY.Free amino acids and peptides as related to antioxidant properties in protein hydrolysates of mackerel(Scomber austriasicus).J Food Nutr Res，2003，36:949-957.

5 Oyaizu M.Antioxidative activities of browning products of glucosamine fractionated by organic solvent and thin-layer chromatography.J Jpn Soc Food Sci，1988，35:771-775.

6 Yen GC，Hsieh PP.Antioxidative activity and scavenging effects on active oxygen of xylose-lysine maillard reaction products.J Sci Food Agric，1995，67:415-420.

7 Decker EA，Welch B.Role of ferritin as a lipid oxidation catalyst in muscle food.J Agr Food Chem，1990，38:674-677.

8 Lee J，Koo N，Min DB.Reactive oxygen species，aging，and antioxidative nutraceuticals.Compr Rev Food Sci F，2004，3:21-33.

9 Liu JL(劉劍利)，Cao XY(曹向宇)，Lu XL(蘆秀麗)，et al.Extraction optimization，purification and antioxidant activity of polysaccharide from Lentinus edodes mycelium.Food Sci(食品科學)，2011，32(12):19-23.

10 Chen H，Ju Y，Li J，et al.Antioxidant activities of polysaccharides from Lentinus edodes and their significance for disease prevention.Int J Biol Macromol，2012，50:214-218.