Tim－1分子在約氏瘧原蟲感染模型中的表達分析

祁贊梅，趙國明，韓 雪，楊 冀，馮 輝，曹雅明

(中國醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院免疫學教研室，遼寧沈陽 110001)

Tim-1是T細胞免疫球蛋白域和黏液素樣域(T cell immunoglobulin domain and mucin domain，Tim)基因家族的分子，表達在T細胞、B細胞、樹突狀細胞等多種免疫細胞表面，為細胞活化提供協(xié)同刺激信號，刺激Th2細胞增殖和分泌細胞因子［1-4］。研究發(fā)現(xiàn)，小鼠體內(nèi)分泌IL-10的調(diào)節(jié)性B細胞(regulatory B cells，Bregs)表面表達Tim-1，Tim-1結(jié)構(gòu)異常導致Bregs數(shù)量和功能缺陷［5-6］。由于Bregs具有抑制Th1應(yīng)答的作用［7］，可以推Tim-1在免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)中，特別是Th1/Th2應(yīng)答的極化發(fā)揮重要的作用。瘧疾是瘧原蟲通過媒介昆蟲蚊傳播的人類最為嚴重的寄生原蟲感染性疾病。抗瘧保護性免疫有賴于Th1和Th2型免疫應(yīng)答的有效建立和協(xié)調(diào)過渡［8-9］。在約氏瘧原蟲P.y17XL感染模型中發(fā)現(xiàn)，BALB/c小鼠原蟲血癥難以控制并最終導致死亡與Th1應(yīng)答難以建立和血漿高水平IL-10有關(guān)［10］。由于Tim-1具有調(diào)節(jié)Th應(yīng)答和維持Bregs功能的作用，本研究觀察了P.y17XL易感和抵抗小鼠中，Tim-1分子表達與Th應(yīng)答及感染結(jié)局的關(guān)系，旨在為瘧疾免疫應(yīng)答調(diào)控提供新靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及瘧原蟲 DBA2和 BALB/c小鼠，6～8周齡，購自北京華阜康生物科技股份有限公司;約氏瘧原蟲P.yoelii 17XL(P.y17XL)由日本愛媛大學分子寄生蟲學教研室贈予曹雅明教授。

1.1.2 主要試劑 抗-CD4-APC(GK 1.5)、抗-CD19-PE/Cy5(6D5)、抗-Tim-1-PE(RMT1-4)、TruStain fcX抗-CD16/CD32(93)及同種型對照均購自美國BioLegend公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime-Script RT Reagent Kit和實時定量 PCR試劑盒SYBR Premix Ex Taq II購自大連寶生物公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物感染 取1× 106P.y17XL寄生的紅細胞(pRBC)經(jīng)腹腔感染小鼠，自感染后3 d經(jīng)尾靜脈采血，制備薄血膜，Giemsa染色，顯微鏡檢計數(shù)紅細胞感染率。

1.2.2 流式細胞術(shù)檢測與分析 在感染后第1、3、5天處死小鼠，無菌取出脾臟，常規(guī)方法制備脾細胞懸液，用0.17 mol/L氯化銨裂解紅細胞。以含10%胎牛血清(FCS)的RPMI 1640調(diào)整脾細胞終濃度為1×107/mL。取0.1 mL脾細胞懸液，加入 TruStain fcX(抗-CD16/CD32)封閉抗體1 μg，于冰上孵育15 min。按廠商推薦劑量加入抗-CD4-APC、抗-CD19-PE/Cy5、抗-Tim-1-PE 單克隆抗體或相應(yīng)熒光標記同種型抗體，于冰上避光孵育30 min。用含0.2%牛血清白蛋白(BSA)的PBS洗滌1次，重懸于含1%多聚甲醛和0.2%BSA的PBS中。于次日進行流式細胞儀(FACAriaⅡ，美國B＆D公司)檢測，每個樣品獲取10 000～50 000個細胞。采用WinMDI 2.9軟件分析數(shù)據(jù)，以同種型對照為參考確定陰陽性細胞界限，結(jié)果以二維點陣圖顯示。

1.2.3 實時定量逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測細胞因子mRNA水平 在感染后第1、3、5天處死小鼠，取少量脾組織，使用Trizol試劑提取總 RNA，按 Prime-Script RT Reagent Kit說明書進行逆轉(zhuǎn)錄。取100 ng RNA的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，按SYBR Premix Ex Ta試劑盒說明書配制20 μL PCR體系，于Corbett Rotor-Gene 6000(Corbett Life Science，Australia)實時定量PCR儀中進行擴增。熱循環(huán)過程:95℃預變性30 s;95℃ 5 s，60℃ 30 s，45個循環(huán)。使用核糖體S17蛋白(RPS17)作為內(nèi)參，利用兩倍系列稀釋樣品制作標準曲線。使用的特異性引物序列如下:RPS17 F:5'-TGTCGGGATCCACCTCAA TG-3';RPS17 R:5'-CGCCATTATCCCCAGCAAG-3';IFN-γ F:5'-AAAGACAATCAGGCCATCAG-3';IFN-γ R:5'-TGGGTTGTTGACCTCAAACT-3';IL-10 F:5'-CAGTACAGCCGGGAAGACA-3';IL-10 R:5'-GCATTAAGGAGTCGGTTAGCA-3';Tim-1 F:5'-TGTTGAGAGTGACAGTGGTCT-3';Tim-1 R:5'-GCCTTGTAGTTGTGGGTCTT-3'。

1.2.4 統(tǒng)計學分析 應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計學分析軟件，Student's t-test比較分析組內(nèi)和組間均值的顯著性差異。P﹤0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 P.y17XL感染的BALB/c和DBA2小鼠原蟲血癥水平和生存率比較

如圖1所示，BALB/c小鼠感染P.y17XL后，外周血紅細胞感染率迅速上升，在感染后6 d達到80%左右，導致8只小鼠在感染后6～7 d全部死亡，而DBA2小鼠的原蟲血癥一直維持較低水平，不超過10%，8只小鼠中只有1只在感染后6 d死亡，其余小鼠在感染后10 d仍然存活，2種小鼠生存率差異具有統(tǒng)計學意義(P﹤0.05)。

2.2 P.y17XL感染的BALB/c和DBA2小鼠脾中IFN-γ和IL-10水平的比較

BALB/c小鼠感染P.y17XL后，脾組織中Th1型細胞因子IFN-γ mRNA水平上升較慢，在感染后第5天僅為未感染小鼠IFN-γ mRNA水平的20倍，而對P.y17XL抵抗的DBA2小鼠在感染后3 d脾IFN-γ mRNA水平就接近正常小鼠的20倍;感染后第3、5天BALB/c小鼠脾 IFN-γ mRNA水平均顯著低于DBA2小鼠，P﹤0.05。同時，BALB/c小鼠脾組織中Th2型細胞因子IL-10 mRNA水平在感染P.y17XL后迅速上升，在感染后第3天和第5天分別為正常小鼠90和200余倍，均顯著高于DBA2小鼠(P﹤0.05和P﹤0.01)。

圖1 BALB/c和DBA2小鼠感染P.y17XL后的原蟲血癥水平(A)和生存率(B)Fig.1 Parasitaemia(A)and survival rate(B)of BALB/c and DBA2 mice infected with P.y17XL

圖2 BALB/c和DBA2小鼠感染P.y17XL后脾組織中IFN-γ mRNA(A)和IL-10 mRNA(B)的水平Fig.2 The mRNA level of IFN-γ (A)and IL-10(B)in the spleens of BALB/c and DBA2 mice infected with P.y17XL

2.3 BALB/c和DBA2小鼠感染P.y17XL后T細胞、B細胞表面Tim-1分子表達的動態(tài)變化

BALB/c小鼠感染 P.y17XL后第3天、第5天，脾細胞中 CD4+Tim-1+和CD19+Tim-1+細胞百分比均較未感染小鼠顯著上升(P﹤0.05)，但是，DBA2小鼠脾 CD4+Tim-1+和 CD19+Tim-1+細胞百分比在感染前后未見顯著變化(圖3)。在BALB/c和DBA2小鼠中，CD19+Tim-1+細胞占脾細胞的百分比均高于CD4+Tim-1+細胞所占百分比，CD19+Tim-1+細胞數(shù)量約為CD4+Tim-1+細胞數(shù)量的2～3倍(數(shù)據(jù)未顯示)。

2.4 P.y17XL感染的BALB/c和DBA2小鼠脾中Tim-1 mRNA水平的動態(tài)變化

P.y17XL感染后，BALB/c和 DBA2小鼠脾組織中Tim-1 mRNA水平逐漸下降，感染后5 d，BALB/c和DBA2小鼠脾組織中Tim-1 mRNA水平均顯著低于未感染小鼠(P﹤0.05)，與脾T、B細胞表面Tim-1分子表達情況并不一致。但是，P.y17XL感染后3 d，DBA2小鼠Tim-1 mRNA水平顯著低于DBA/2小鼠(P﹤0.01)。

圖3 BALB/c(A)和DBA2(B)小鼠感染P.y17XL后脾細胞中CD4+Tim-1+和CD19+Tim-1+細胞的百分比Fig.3 The percentage of CD4+Tim-1+cells and CD19+Tim-1+cells in the splenocytes of BALB/c(A)and DBA2(B)mice infected with P.y17XL

圖4 BALB/c和DBA2小鼠感染P.y17XL后脾組織中Tim-1 mRNA的水平Fig.4 The mRNA level of Tim-1 in the spleens of BALB/c and DBA2 mice infected with P.y17XL

3 討論

本文探討了鼠瘧模型中淋巴細胞表面Tim-1分子表達與細胞因子分泌譜和感染結(jié)局的關(guān)系。結(jié)果顯示:對P.y17XL易感的BALB/c小鼠在感染過程中產(chǎn)生高水平的Th2型細胞因子IL-10，脾T、B淋巴細胞中Tim-1+細胞百分比在感染過程中顯著上升;而對P.y17XL抵抗的DBA2小鼠在感染過程中產(chǎn)生高水平的Th1型細胞因子IFN-γ，其脾T、B淋巴細胞中Tim-1+細胞百分比無顯著變化。提示具有調(diào)控 Th1/Th2極化功能的Tim-1分子可能參與抗瘧疾免疫應(yīng)答的調(diào)控。

Tim-1分子最初被發(fā)現(xiàn)表達在 CD4+T細胞［11］，而后，在肥大細胞、B 細胞、樹突狀細胞、自然殺傷細胞等多種免疫細胞表面都發(fā)現(xiàn)有Tim-1分子表達［1-4］。結(jié)果顯示，在小鼠脾細胞淋巴細胞中，Tim-1主要表達在B細胞表面而非T細胞上，與Rothstein等［5］的報道一致。本課題研究還顯示，BALB/c小鼠感染過程中，Tim-1+B細胞百分比逐漸上升，由于大部分調(diào)節(jié)性B細胞表達Tim-1 分子［5］，本研究推測，P.y17XL 感染的 BALB/c小鼠中，Tim-1+調(diào)節(jié)性B細胞可能被活化，并參與抑制 Th1應(yīng)答。BALB/c小鼠Tim-1分子與DBA2小鼠比較，有較長的黏蛋白區(qū)，該區(qū)域?qū)τ谡{(diào)節(jié)性B細胞的抑制功能有重要作用［6，12］。研究中發(fā)現(xiàn)，DBA2小鼠感染過程中，Tim-1+T、B細胞百分比沒有出現(xiàn)明顯變化，可能與其Tim-1分子黏蛋白區(qū)域缺失導致Tim-1信號缺陷有關(guān)。另外，P.y17XL感染過程中，雖然BALB/c小鼠脾中Tim-1+T、B細胞百分比在感染過程中逐漸上升，且脾細胞總數(shù)也有明顯升高，但BALB/c和DBA2小鼠脾組織中Tim-1 mRNA水平卻逐漸下降。這種mRNA水平和細胞水平Tim-1分子表達差異的原因尚不清楚，可能存在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機制;或Tim-1分子在其他類型細胞中的表達下降，導致脾組織中Tim-1 mRNA總體水平降低。

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