癌-睪丸抗原S S X基因在肝細胞癌中mRNA水平的表達及意義

肖瑞雪 農蔚霞 宋 瓊 陳 芳 何少健

廣西醫科大學組織胚胎學教研室，廣西南寧 530021

癌-睪丸抗原（cancer-testisantigen，CTA）是一類限制性表達于正常睪丸和腫瘤的抗原，它曾被認為與癌的發生有關。近幾年來，CTA 被看作是癌癥免疫療法的理想靶點而倍受關注[1]。CTA的編碼基因通過誘導人體的免疫細胞引起特殊的體液免疫和細胞免疫反應。已有報道指出，CTA 家族中某些基因已經用于腫瘤的分子診斷和免疫治療[2]。

滑膜肉瘤X 斷裂點基因 （synovial sarcoma，X breakpoint gene），又稱SSX 基因，是多個成員的基因家族，它們均位于X 染色體p11.23～p11.22 位，作為CTA 家族成員之一，其只在睪丸、胎盤等具有血液屏障的正常組織中表達。對SSX 基因序列和功能研究發現，SSX 基因表達產物的主要功能為轉錄抑制。SSX 基因編碼的蛋白有兩個功能區：SSX-KRAB 區（SSX-related kruppel associated box domain）和 SSX-RD 區（SSX-repression domain）[3]，而 SSX-KRAB 區的結構域所編碼的蛋白又隸屬于KRAB-鋅指蛋白亞群但其抑制轉錄的功能微弱，甚至是無效的；另一功能區SSXRD 功能發揮是通過對核內染色質進行修飾而達到抑制轉錄作用[4]。

Tureci 等[5]在325 份不同組織來源的腫瘤樣品中分析SSX1-5 基因家族mRNA的表達情況時發現，除SSX-3 以外其余4 種基因至少有一種基因在腫瘤樣品中有表達。Ayyoub 等[6]對6 種不同組織類型的10個滑膜肉瘤細胞系進行SSX1～5 基因mRNA 表達調查發現，兩種以上基因同時表達的占60%，全部腫瘤細胞至少表達一種上述基因。Naka 等[7]在研究骨肉瘤SSX 基因表達情況時發現，17個患者標本中有16個患者的標本至少表達SSX1～5 基因中的一種。綜合上述，SSX 基因家族在腫瘤患者中mRNA的表達情況發現，整個SSX 基因家族在癌組織中處在相對較高的表達頻率，而且也存在基因共同表達情況。因此，研究針對SSX 基因家族不同成員均有作用的抗原表位，勢必可以提高基于SSX 基因家族腫瘤免疫治療的應用價值。

本研究采用RT-PCR 方法，針對肝癌組織和肝癌細胞株中SSX 基因家族mRNA 表達和共表達情況進行深入研究，為基于SSX 基因家族的腫瘤免疫治療和多價疫苗的研究提供理論和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

肝癌細胞株Bel-7404 購自上海細胞所，肝癌細胞株HePG2 由廣西醫科大學微生物學專業宋德志老師惠贈，肝癌細胞株7721 來自廣西醫科大學組織胚胎學實驗室培養傳代，正常細胞株（陰性對照）7702 由廣西醫科大學實驗中心蔡新老師惠贈。

收集2009年2月～2010年10月于廣西醫科大學第一附屬醫院肝膽外科和肝移植科住院患者的外科手術切取組織。組織標本包括28例肝細胞癌及癌旁組織，3例肝硬化組織。標本的臨床分期依據1977年全國肝癌防治協作會議TNM分期標準。28例肝癌組織中包括11例結節型肝癌，13例巨塊型肝癌，4例彌漫型肝癌，其中14例處于TNM分期的Ⅰ～Ⅲ期，14例處于Ⅳ期。患者年齡22～86歲，平均50歲，其中，男24例，女4例。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 細胞培養采用RPMI 1640 培養基 （包括10%胎牛血清，100 μ/mL 青霉素和100 U/mL 鏈霉素）于含5%CO2的37℃恒溫培養箱中培養。

1.2.2 總RNA 提取將手術后切取的肝癌組織和癌旁組織迅速放入液氮中，然后盡快轉移至-80℃冰箱內。用Trizol試劑（上海寶生物公司）提取組織和細胞中的總RNA，紫外分光光度計測定A260/A280值，1%瓊脂糖凝膠電泳證實RNA完整性。取500 ng 總RNA，用RT-PCR 試劑盒DRR019A（TAKARA公司）合成cDNA，反應條件和反應體系參考試劑盒說明書。

1.2.3 半定量 RT-PCR 檢測 SSX-1、SSX-2、SSX-3 mRNA表達 采用RT-PCR 法檢測SSX1、SSX-2、SSX-3 mRNA 表達。所用引物及擴增片段如下，SSX-1（422 bp）上游引物：5'-CTAAAGCATCAGAGAAGAGAAGC-3'，下游引物：5'-AGATCTCTTATTAATCTTCTCAGAAA-3'；SSX-2 （435bp）上游引物：5'-GTGCTCAAATACCAGAGAAGATC-3'，下游引 物 ：5'-TTTTGGGTCCAGATCTCTCGTG-3'；SSX-3 （378 bp）上游引物：5'-GGAAGAGTG GGAAAAGATGAAAGT-3'，下游引物：5'-CCCCTTTTG GGTCCAGATATCA-3'；內參p53（763 bp）上游引物：5'-CGTGAGCGCTTCGAGATGTTCCG-3'， 下游引物：5'-CCTAACCAGCTGCCCAACTGTAG-3'。PCR 反應條件：SSX-1 為56℃退火30 s，擴增40個循環；SSX-2 為 54℃退火 30 s，擴增 40個循環；SSX-3 為61℃退火30 s，擴增40個循環；內參p53 為65℃退火40 s，擴增35個循環。隨機選取每個基因中6個陽性表達的PCR 產物進行DNA 序列測定。PCR 引物的合成由上海捷瑞公司進行，產物的純化和序列測定由北京諾賽公司完成。

1.3 統計學方法

應用SPSS 13.0統計學軟件進行數據分析，計數資料用率表示，組間比較采用 χ2檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RT-PCR 測序結果

隨機抽取的陽性表達PCR 產物進行DNA 測序，所得序列與基因庫檢索序列一致，證實所擴增產物為目的基因的片段。

2.2 SSX mRNA 在肝癌細胞株的表達

在肝癌細胞株 7404、HePG2、7721 中，SSX-1、SSX-2、SSX-3 mRNA的表達不同，但是在每一種細胞株中至少有一種基因表達。 在 7404（圖 1）中，有 SSX-1（422 bp）和SSX-3（378 bp）表達；在 HePG2（圖 2）中，有 SSX-2（435bp）和 SSX-3（378 bp）表達；在 7721（圖 3）中，只有 SSX-3（378 bp）表達。 p53（763bp）作為內參，均有表達。

2.3 SSX mRNA 在肝癌及癌旁組織中的表達

SSX 基因在癌旁組織和肝硬化組織中均不表達。在肝癌組織中，SSX-1、SSX-2、SSX-3的表達陽性率分別為53.6%、35.7%、57.1%。 p53（763 bp）作為內參，均有表達。 見圖4。

2.4 SSX 表達率與肝癌臨床指標的關系

SSX mRNA 表達與肝癌患者的性別、年齡、HBV、AFP、病理分型、TNM分期、門靜脈癌栓和肝硬化發生與否無顯著相關性（P＞0.05）。見表1。

表1 SSX表達與臨床指標的關系[n（%），n=28]

2.5 3 種SSX 基因共同表達情況

28例肝癌組織中，6例（21.4%）標本3 種SSX 基因均有表達，23例（82.1%）標本至少表達兩種SSX 基因。

3 討論

本研究課題所收集的肝細胞癌組織中SSX-1、SSX-3基因表達陽性率較高 （53.6%、57.1%），SSX-2 表達陽性率相對較低（35.7%）。這與以往研究所證實的SSX 基因家族在肝癌中有較高表達相一致[8-10]，其高表達的特性（表達率大于50%）提示該基因家族可能與肝癌的發生、發展密切相關。本研究28例肝癌組織中，6例（21.4%）標本3 種SSX基因均有表達，23例 （82.1%）標本至少表達兩種SSX 基因；離體培養的肝癌細胞株7404、HePG2、7721 中SSX1～3基因的表達雖各不相同，但至少有一種基因表達，同時也存在基因的共表達。這3 種基因同時表達為采用多價疫苗進行肝癌的免疫治療提供了實驗依據。同時，本研究課題在癌旁組織和正常肝細胞株中沒有檢測到SSX 基因的表達，與Chen 等[11]發現在肝癌的少數癌旁組織中有微弱的SSX 基因表達不相符，原因可能與樣本量較少有關，可擴大樣本量后再深入研究驗證。SSX 基因在肝癌中高頻率表達，而在非癌中不表達，又為肝癌特異性免疫治療提供了潛在靶位。

目前對于肝癌的診斷仍以AFP的檢測和影像學檢查為主，這兩種方法都可能出現假陽性和假陰性，所以尋找一種特異性更高的診斷方法成為臨床上的迫切所需。本研究結果與肝癌臨床指標結合后發現：SSX1～3 基因表達與年齡、性別、病理分型、TNM分期、HBV、血清AFP 水平、門脈癌栓、肝硬化無顯著相關性（P＞0.05）。而研究結果又顯示：相當一部分AFP 正常（≤ 20 μg/L）肝癌患者存在SSX基因表達，提示可以將SSX1～3 基因mRNA 作為腫瘤標志物，用于肝癌的輔助診斷。

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