莖環結構DNA電化學傳感芯片對PML/RARα mRNA的檢測

陳 婧

（廈門大學附屬第一醫院,福建 廈門,361000）

急性早幼粒細胞白血病（APL）是一種常伴有嚴重出血的急性白血病，PML/RARα融合基因是其特異的分子學標志，檢測PML-RARα融合基因能夠協助急性早幼粒細胞白血病診斷。電化學DNA傳感技術是近年來迅速發展的一種檢測手段，具有方便、快捷、靈敏、低廉等優點。其近年新興起的多通道生物傳感芯片技術結合能夠實現一次操作多次檢測，高效快捷具有廣泛的應用前景。

本文根據PML/RARα融合基因的堿基序列設計了莖環結構探針,并構建了多通道電化學傳感芯片對PML/RARα 融合基因進行了檢測，研究了其特異性、靈敏性、重現性等方面的性能。

1 實驗

1.1 主要試劑

主要試劑：以下寡核苷酸由從寶生物工程（大連）有限公司（TaKaRa）

1.2 APL靶序列探針的設計

根據NCBI基因數據庫，查找出 PML/RARα融合基因的融合位點，選擇位點前后的堿基作為探針使用，同源比對顯示APL的特異性序列為：5‘-…-GGG GAG GCA G CCA TTG AGA CCC-…-3’

1.3 HP/MCH芯片的制備

莖環結構（HP）的捕獲探針需要預先形成環，把HP儲備液用探針成環溶液配成適當的濃度，4℃過夜，備用。將3.2μL不同組裝密度在組裝液滴加在金電極表面上，室溫靜置2小時后，用Tris-HCl緩沖液洗去未連接的莖環探針。在已組裝HP的通道中加入在2 mM的巰基己醇（MCH）100μL，室溫密閉過夜。MCH處理后的芯片通道表面上固定了一層捕獲探針和巰基分子的混合組裝層。

1.4 與靶mRNA的雜交

用Tris-Hcl 緩沖液清洗組裝好的芯片，而后在37℃下將芯片與目標靶mRNA雜交30分鐘。放置至室溫后，再用Tris-Hcl洗液洗去未雜交的mRNA。而后在通道中滴加100μL 0.1%BSA溶液，室溫放置一刻鐘，再次用Tris-Hcl洗液沖洗，N2氣吹干表面后添加3.2 μL 50 U/mL的avidin修飾的辣根過氧化物酶（avidin-HRP），avidin與biotin反應后將HRP固定在芯片通道表面上。

1.5 電化學方法檢測量

在CHI660C型電化學工作站（CH Instruments Inc）和多通道自動切換裝置（福州大學研制）上進行電化學實驗，多通道芯片（WEST CHESTER, PA USA）上的每個通道均含有工作電極、參比電極以及輔助電極。電化學檢測室溫下在TMB溶液和RuHex溶液中進行，采用的電化學方法為計時電流法（I-T）、循環伏安法 (CV)及計時電量法（CC）。

2 結果與討論

2.1 HP探針的堿基多態性研究

用電流-時間曲線（i-t）來研究探針修飾的電化學DNA多通道傳感芯片的特異性。結果如圖1所示，圖1A-1為HP與不同序列雜交后的i-t曲線。圖中曲線由f到a依次為HP探針與空白的緩沖溶液（background）、完全不匹配的mRNA、PML-mRNA、100 nM RARα -mRNA、單堿基不匹配mRNA和100 pM APL mRNA在室溫下進行充分雜交后的電流信號。圖1 A-2中顯示單堿基不匹配、PML-mRNA、RARα-mRNA及完全不匹配的信號強度相對于完全互補的信號強度明顯偏弱。

我們還通過莖環結構探針對mRNA電化學雜交，檢測了靶mRNA序列及其存在不同單堿基不匹配的3段序列的計時電流信號進行了檢測與對比，如圖1 B。圖1 B-2顯示，當靶序列中有單不匹配堿基存在時信號強度只能達到完全匹配靶序列的1/3左右，只有當堿基為 G時即與探針完全互補時，信號增量才較大

通過以上對比，表明莖環結構探針具有較好的序列特異性，對不匹配堿基序列具有更好的識別作用。

2.2 HP探針對不同濃度靶mRNA的檢測

用計時電流法對靶mRNA進行定量研究。室溫下，對不同濃度的靶序列進行雜交檢測，考察該莖環結構探針DNA傳感芯片的靈敏度，結果如圖2。圖2A中靶mRNA濃度從i到a分別為0.5 pM、1 pM、10 pM、50 pM、250 pM、 500 pM、1 nM 、5 nM 和 10 nM。結果顯示電流值隨著濃度的增加而增加，并且濃度在0.5-300 pM范圍內時，電流值（I）與mRNA濃度（c）具有較好的線性關系（圖2 B）, 線性回歸方程為I(nA)=364.6992+2.8741 cmRNA (pM)，r = 0.9955, 檢出限（S /N = 3）為 5.0×10-14 M

圖1 HP對靶mRNA的堿基多態性檢測結果

圖2 A不同濃度的雜交鏈電化學信號比較；B: 電流強度與目標mRNA濃度的線性關系圖（0.5-300 pM）

2.3 重現性考察

為了考察實驗的重現性，對1 nM的靶mRNA溶液平行測定5次，結果顯示其相對標準偏差（RSD）為10.3%。這說明這種測試方法具有良好的重現性。

3 結論

本文對莖環結構探針修飾的多通道傳感芯片的性能進行了考察，結果表明，該傳感芯片具有良好的特異性，能較好地區分完全不匹配序列、RARα-mRNA、PML-mRNA、單堿基不匹配序列和靶序列，甚至能夠較好地識別同一位點不同不匹配堿基的序列。該探針與靶mRNA雜交后，電流值與靶序列濃度在0.5-300 pM范圍內呈線性關系，對靶序列的檢出限也非常低為5.0×10-14 M，這表明該探針具有較好的靈敏性。進一步優化實驗條件后，有望應用于實際樣品的檢測，可以滿足基因分析和臨床診斷的需要，具有很好前景。

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