產3-羥基丙酸重組大腸桿菌JM109的構建及發酵條件優化

張曉梅 李新生 許正宏

3-羥基丙酸（3-hydroxypropionic acid，簡稱3-HP），又名β-羥基丙酸，是一種較為活潑的分子，可以用來合成多種重要的化工產品，還可以用于生產醫藥產品以及個人護理用品，所以其在商業上具有重大的開發價值［1］。目前，3-HP的生產方法主要是化學合成法，然而采用化學合成法生產3-HP難度較大，且產品分離純化較復雜，生產成本相應較高。微生物發酵法與化學法相比，具有成本低、操作簡單、條件溫和、副產物少及綠色環保等優點。利用自然篩選的微生物還無法直接進行發酵法生產3-HP。因此，利用基因工程技術構建高產菌株被認為是今后的研究方向［2］。

微生物轉化法生產3-HP有兩條途徑：以大腸桿菌為宿主菌，以葡萄糖［3-5］和甘油［6，7］為底物的生物轉化路線。Cameron在專利中首次報道了甘油能在甘油脫水酶（來源于克雷伯氏菌）的作用下生成3-羥基丙醛（3-HPA），后者在醛脫氫酶（來源于釀酒酵母）的繼續作用下生成3-HP［3-5］，但是，由于修飾系統的及啟動子原因，來自于釀酒酵母的Aldh活性在大腸桿菌中始終較低。Raj等［6］以E.coli BL21（DE3）為宿主共表達了來源于克雷白氏肺炎桿菌（K.pneumoniae）DSM2026的甘油脫水酶DhaB和來源于E.coli K-12 MG1655的乙醛脫氫酶AldH，該重組菌可以直接利用甘油生產3-HP，但其產量僅為0.58g/L，進一步優化載體及誘導條件后，3-HP的最高產量達到4.4g/L［7］。最近有研究者報道了以K.pneumoniae 作為宿主菌，以甘油作為底物構建了產3-HP 基因工程菌，但由于K.pneumoniae 將更多的甘油轉化成為1，3-丙二醇，因此3-HP的轉化率難以提高［8，9］。本研究室在前期構建了能轉化甘油為3-HP的含有雙質粒的重組大腸桿菌JM109（pUCtacaldh，pEtac-dhaB），其 3-HP 的產量為 4.9g/L［10］。由于雙質粒存在穩定性的問題，因此在前期研究基礎上構建了在一個質粒上串聯表達兩個關鍵酶基因的重組質粒pEtac-dhaB-aldh，然后轉化大腸桿菌E.coli JM109，得到了含有單一質粒、可以利用甘油產3-HP的重組菌E.coli JM109（pEtac-dhaB-aldh），應用響應面分析法對影響重組菌E.coli JM109（pEtac-dhaB-adlh）發酵的各因素最佳水平范圍及其交互作用進行探討，旨為微生物發酵法生產3-HP奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒 大腸桿菌（Escherichia coli）JM109，由本實驗室保藏，質粒載體pUCtac-aldh，pEtac-dhaB由本實驗室先期構建和保藏［11，12］。

1.1.2 工具酶和試劑 限制性內切酶Xba I、Pst I，堿性磷酸酶CIAP購自TaKaRa 公司；T4 DNA連接酶及Taq DNA聚合酶購自上海華美生物工程公司；Gel Extraction Mini Kit、PCR Purification Mini Kit 購自上海華舜生物工程有限公司。丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、廣范圍蛋白質分子量標準為Promega公司產品。

1.1.3 SDS-PAGE 采用5％濃縮膠及12％分離膠的不連續垂直平板電泳，考馬斯亮藍R-250染色。以大腸桿菌JM109作對照。

1.1.4 培養基和培養條件 LB培養基（g/L）：蛋白胨10，酵母膏5，氯化鈉10，固體培養基含20g/L的瓊脂，固體和液體培養基在需要時加入卡那霉素。種子培養基：采用LB培養基。

發 酵 培 養 基（g/L）：（NH4）2SO42.0，MgSO4·7H2O0.2，FeSO4·7H2O0.005，CaCl20.1，2mol/L KOH調pH值7.0。維生素B12、甘油、酵母膏及KH2PO4根據試驗方案設計。發酵：從新鮮的LB培養基斜面上挑取一環菌株接入50mL 搖瓶（裝液量為10mL）中，于旋轉式搖床中30℃、140r/min培養16h 得到種子液。按5％接種量接入500mL搖瓶（裝液量50mL）中，在140r/min旋轉式搖床中，培養至OD600為0.7，再加入1mmol/L IPTG誘導過夜，同時以未加入IPTG誘導的發酵液為對照。發酵條件優化試驗根據試驗方案改變培養基及培養條件進行發酵。

1.2 方法

1.2.1 重組菌E.coli JM109（pEtac-dhaB-aldh）質粒穩定性分析 單細胞生物的細胞呈幾何級數2n增長，當n=20時，220=1.05×106，將穩定期的菌液稀釋10-6，再將其培養到穩定期，即可認為細胞已連續傳代20次。具體方法如下：從新鮮轉化平板上挑取單菌落。接種至2mL不含抗生素的LB中，30℃培養24h，即得20代的菌液，以此類推，直至連續傳代至100代。其中每隔20代統計1次質粒丟失情況，將上述菌液涂布于不含抗生素的LB板上，從中挑選100個單菌落分別點在添加和不添加抗生素的平板上，通過計數即可測得該代數的質粒穩定性。

1.2.2 測定方法 生物量用比色法檢測（OD600）光密度法檢測。發酵液中3-HP含量的檢測方法：采用高效液相色譜法，其最佳HPLC條件：色譜柱Diamonsal C18（5μm，250mm×4.6mm）；流動相 ：甲醇∶水=5∶95，加入H3PO4至0.05％；洗脫條件為：流動相平衡60min，洗脫時間20min，流速為0.8mL/min；檢測器：紫外檢測器。柱溫：30℃。

甘油的檢測方法：采用高效液相色譜法檢測。其最佳HPLC條件：色譜柱：ZORBAX NH2（5μm，250mm×4.6mm）；流動相：乙腈和水的配比為70：30；流動相平衡60min，洗脫時間20min，流速為1mL/min；檢測器：示差檢測器。

2 結果

2.1 重組質粒穩定性分析

用含卡那青霉素50μg/mL篩選得到重組大腸桿菌E.coli JM109（pEtac-dhaB-aldh），重組大腸桿菌E.coli JM109（pEtac-dhaB-aldh）在無卡那霉素選擇壓力的條件下，連續轉種5次，統計重組大腸桿菌E.coli JM109（pEtac-dhaB-aldh）的菌落數。結果（表1）顯示，傳100代后重組大腸桿菌E.coli JM109（pEtacdhaB-aldh）的質粒保持率為82％。

表1 重組菌E.coli JM109（pEtac-dhaB-aldh）連續轉種后在平板上的菌落數

2.2 重組菌全細胞蛋白SDS-PAGE電泳分析

挑取E.coli JM109（pEtac-dhaB-aldh）接種于含有卡那霉素50μg/mL的LB培養基中，37℃培養至對數后期，1mmol/L IPTG誘導培養5h，離心收集菌體，超聲波破壁，加入1倍的SDS-PAGE電泳加樣緩沖液中懸浮，100℃水浴5min，進樣量為10μL，重組菌E.coli JM109（pEtac-dhaB-aldh）全細胞蛋白SDS-PAGE電泳分析如圖1所示。從圖1可以看出，其中61、21和16kD處出現蛋白質特征帶正好對應甘油脫水酶DHAB三個亞基分子量的位置，說明已經存在表達產物。另外在54、49和12kD處出現蛋白質特征帶正好與乙醛脫氫酶酶ALDH蛋白大小相符，說明表達產物中已經存在乙醛脫氫酶酶蛋白。

2.3 重組菌的生長曲線

分別接種單菌落重組菌E.coli JM109（pEtacdhaB-aldh）于100mL LB培養基（含卡那霉素50μg/mL），37℃，120r/min培養 36h，每隔 2h取一次樣，重組菌的生長曲線如圖2。根據重組菌的生長曲線的結果，確定將重組菌E.coli JM109（pEtacdhaB-aldh）的種子培養液接入發酵培養基的接種時間確定為16h。

圖1 重組菌表達產物的SDS-PAGE電泳分析

圖2 重組菌E.coli JM109（pEtac-dhaB-aldh）生長曲線

2.4 單因素試驗結果

2.4.1 初始甘油濃度對重組菌發酵的影響 考察重組菌發酵甘油產3-HP的能力，對該重組菌在不同初始甘油濃度 20、30、40、50、60、70 以及 80g/L（其中酵母膏6g/L、KH2PO47.5g/L、VB120.02g/L）的發酵培養基中37℃，140r/min，發酵48h，結果如圖3所示。從圖3可以看出，當甘油濃度在50g/L時，3-HP的產量最高可以達到3.4g/L。

2.4.2 維生素B12濃度對重組菌發酵的影響 發酵培養基中初始甘油濃度為50g/L時，考察了VB12的濃度對發酵的影響，結果如圖4。從圖4可以看出，當VB12的濃度0.05g/L時，培養條件為37℃，140r/min培養48h，發酵液中3-HP產量3.8g/L。

圖3 甘油濃度對重組菌發酵產3-HP的影響

圖4 VB12濃度對重組菌發酵產3-HP的影響

2.4.3 磷酸二氫鉀濃度對重組菌發酵的影響 在初始甘油50g/L，VB12的濃度0.05g/L時，培養條件為37℃，140r/min培養48h，考察了KH2PO4濃度對產3-HP重組菌發酵結果的影響（圖5）。由圖5可知，當KH2PO4濃度為6g/L時，3-HP產量可達4.1g/L。2.4.4 酵母膏濃度對重組菌發酵的影響 發酵培養基中初始甘油濃度為50g/L，VB12的濃度為0.05g/L，KH2PO4濃度為6g/L時，培養條件為37℃，140r/min培養48h，考察了酵母膏濃度對重組菌發酵產3-HP的影響。由圖6可看出，當酵母膏濃度為5g/L時，3-HP的產量達到4.5g/L。但是隨著酵母膏濃度的增大，3-HP的產量逐漸下降，分析原因可能是由于酵母膏濃度增大導致菌體生長和其他代謝產物的形成。因此，合適的酵母膏濃度對于維持重組菌3-HP的較高產量水平也是至關重要的。

圖5 KH2PO4濃度對重組菌發酵產3-HP的影響

圖6 酵母膏濃度對重組菌發酵產3-HP的影響

2.5 響應面分析（RSA）試驗設計

單因素發酵結果表明3-HP的含量主要取決于底物甘油的濃度，甘油脫水酶輔酶VB12的濃度，KH2PO4及氮源酵母膏的濃度，進一步采用響應面分析的方法考察4個因素間的交互影響，進而提高3-HP的產量。將甘油濃度，甘油脫水酶輔酶VB12濃度，KH2PO4及酵母膏的濃分別記為變量X1、X2、X3、X4，以3-HP（g/L）作為響應值，記為變量Y。根據Box-Behnken 的中心組成設計原理，設計了4因素3水平的響應面分析（RSA）試驗，共有27個試驗點，依據單因素試驗結果選取試驗因素與水平，見表2；利用統計分析軟件Stat-Ease/Design-Expert6.12 對試驗結果進行分析。

通過二次回歸的旋轉中心結合設計，對這4個顯著因素進行尋優，以3-HP的產量為響應值，對應于因變量Y 。運行SAS 軟件得到試驗設計表及試驗結果如表3 所示。

表2 因素與水平取值表

表3 響應面設計表及試驗結果

SAS 分析所得到的擬合全變量二次回歸方程各變量的偏回歸系數估計值及方差分析結果見表4及表5。

當顯著性檢驗P＜0.05時，經SAS分析X1，X3，X4，，X2X3，的P值均小于0.05（表5中帶有*標記），因此全變量二次回歸方程為：

Y=4.91+1.215* X1+0.26* X3+0.181*X4 -2.2*-0.71*-0.388 X2X3-0.425-0.510*。

表4 方差分析表

變量系數（CV）= 10.4929；R2=0.9839

表5 回歸方程偏回歸系數的估計值

對全變量的二次回歸模型進行規范分析，考察所擬合的相應曲面形狀。獲得的響應面立體圖如圖7-圖12 所示。

圖7顯示了KH2PO4及酵母膏位于中心水平，即6g/L和5g/L時，甘油與VB12對重組菌產3-HP性能的等高線圖及響應面圖。從圖7可以看出，當維持VB12的濃度在一定范圍內，3-HP的產量隨著甘油濃度的升高而增加，但到一定水平時，3-HP的產量隨著甘油濃度的升高反而下降，當甘油濃度在0.2-0.6（58-74g/L），VB12在 -0.6-0.6（0.02-0.07g/L）范圍內，3-HP的產量大于4g/L。

圖8顯示了甘油與KH2PO4對重組菌產3-HP性能的交互影響效應，等高線的形狀能反映出交互效應的強弱的大小，圓形表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓形與之相反。從圖中可以看出，當KH2PO4在一定范圍內，3-HP的產量隨著甘油濃度的升高而增加，當甘油濃度在0.2-0.6（58-74g/L），KH2PO4在-0.6-0.9（4.2-8.7g/L）范圍內，3-HP的產量大于4.8g/L。

圖8 甘油與KH2PO4對重組菌產3-HP影響的等高線圖及響應面圖

圖9顯示了甘油與酵母膏對重組菌產3-HP性能的交互影響效應，從圖中可以看出，當酵母膏在一定范圍內，3-HP的產量隨著甘油濃度的升高而增加，當甘油濃度在0.2-0.6（58-74g/L），酵母膏在-0.6-0.8（2.6-8.2g/L）范圍內，3-HP的產量大于4.4g/L。

圖10顯示了VB12與KH2PO4對重組菌產3-HP性能的交互影響效應，從圖10的等高線圖可以直觀地看出兩因素的交互作用較為顯著，同樣從表5對回歸方程的顯著性檢驗得到VB12與KH2PO4交互作用顯著（P=0.0097＜0.05）。從圖10還可以看出，當KH2PO4在一定范圍內，3-HP的產量隨著VB12的升高而增加，維持發酵培養基中足夠高的VB12濃度，對于保證3-HP產量是必需的。當VB12濃度在-0.6-0.5（0.02-0.075g/L），KH2PO4在 -0.4-0.9（4.8-8.7g/L）范圍內，3-HP的產量大于3.9g/L。

圖11顯示了VB12與酵母膏對重組菌產3-HP性能的交互影響效應，從圖11可以看出，VB12與酵母膏的交互作用不明顯，當VB12濃度在-0.4-0.5（0.03-0.075g/L）， 酵 母 膏 在0.3-0.6（6.2-7.4g/L）范圍時，3-HP的產量大于3.9g/L。

圖9 甘油與酵母膏對重組菌產3-HP的影響等高線圖及響應面圖

圖10 VB12與KH2PO4對重組菌產 3-HP影響的等高線圖及響應面圖

圖11 VB12與酵母膏對重組菌產 3-HP影響的等高線圖及響應面圖

圖12顯示了KH2PO4與酵母膏對重組菌產3-HP性能的交互影響效應，從圖12可以看出，當酵母膏濃度在 -0.4-0.7（4.84-5.8g/L），KH2PO4在 -0.3-0.8（4.8-8.4g/L）范圍時，3-HP的產量大于4.8g/L。對模型方程進行典型性分析說明，模型具有穩定點，穩定點為其最大值。培養基最優組成為：甘油 62g/L、VB120.05g/L、KH2PO47.4g/L及酵母膏 6.2g/L，在此培養基中3-HP產量的最大估計值為5.4g/L。

圖12 KH2PO4與酵母膏對重組菌產 3-HP影響的等高線圖及響應面圖

2.6 模型的驗證

以響應面試驗優化得到的最佳培養基配方組成為（g/L）：甘油 62g/L、VB120.05g/L、KH2PO47.4g/L及酵母膏 6.2g/L；在此培養基條件下，進行3次發酵試驗，發酵液中3-HP的濃度分別為5.2g/L，5.8g/L，5.3g/L與模型計算值5.4g/L相近似，預測值與試驗值之間的良好擬合性證實了模型的有效性及存在著極大值點，證明響應面方法對培養基優化有效。

3 討論

由于來源不同的質粒在同一宿主細胞中存在著許多不定因素，對菌體的生長和外源基因的表達都有影響，最終對產物的生成也會造成一定影響。而質粒的穩定性是重組菌高水平發酵生產的一個基本條件，因此將甘油代謝產3-HP途徑中兩個關鍵酶基因進行串聯表達，可以有效的提高重組質粒在宿主菌中的穩定性，從而在一定程度上提高重組大腸桿菌合成3-HP的能力。利用微生物發酵生產3-HP可以有效避免化學合成的不利因素，從甘油到3-HP的生物合成途徑中，DHAB需要VB12作為輔酶才能催化甘油至3-羥基丙醛（3-HPA）的反應［13］。Toraya等［14］研究表明，如果將與之結合的被修飾的輔酶B12或VB12與自由態輔酶B12進行交換，可以恢復DHAB的催化活性。維持發酵培養基中足夠高的VB12濃度，對于激活DHAB活性和防止因甘油導致的自殺性失活，從而保證較高水平3-HP的產量是必需的，合成途徑的唯一中間產物為3-羥基丙醛，其濃度過高將抑制菌體的生長和甘油的代謝［15］，從而抑制DHAB的活性。因此，要實現3-HP 在重組大腸桿菌的大量積累，DHAB的活性起著關鍵性作用，而如何實現其活力的提高將是以后研究的重點。

4 結論

將編碼乙醛脫氫酶編碼基因aldh連接重組質粒pEtac-dhaB轉化大腸桿菌，成功構建產3-羥基丙酸（3-HP）重組大腸桿菌JM109（pEtac-dhaB-aldh）。單因素試驗考察了甘油、 VB12、KH2PO4及酵母膏的濃度對重組菌發酵產3-HP的影響，進一步通過響應面分析優化了重組菌發酵培養基，優化培養基組成為（g/L）：甘油62g/L、VB120.05g/L、KH2PO47.4g/L及酵母膏 6.2g/L，在此培養基中3-HP的產量為 5.8g/L。

［1］ 張鴻達, 劉成, 高衛華, 等.微生物發酵法生產3-羥基丙酸的研究進展［J］.化工進展, 2007, 26（1）：33-37.

［2］ Jiang XL, Meng X, Xian M.Biosynthetic pathways for 3-hydroxypropionic acid production ［J］.Applied Microbiology and Biotechnology, 2009, 82（6）：995-1003.

［3］ Gokarn RR, Selifonova OV, Jessen HJ, et al.3-hydroxypropionic acid and other organic compounds：WO,0242418 A2［P］.2001.

［4］ Cameron DC, Suthers PF.Production of 3-hydroxypropanoic acid in recombinant organisms：WO,0116346 ［P］.2001.

［5］ Suthers PF, Cameron DC.Production of 3-hydroxypropionic acid in recombinant organisms：US, 6852517 ［P］.2005.

［6］ Raj SM, Rathnsingh C, Jo JE, et al.Effect of process parameters on 3-hydroxypropionic acid production from glycerol using a recombinant Escherichia coli ［J］.Appl Microbiol Biotechnol, 2009, 84：649-657.

［7］ Raj SM, Rathnsingh C, Jo JE, et al.Production of 3-hydroxypropionic acid from glycerol by a novel recombinant Escherichia coli BL21 strain ［J］.Process Biochem, 2008, 43：1440-1446.

［8］ Huang Y, Li Z, Shimizu K, et al.Simultaneous production of 3-hydroxypropionic acid and 1, 3-propanediol from glycerol by a recombinant strain of Klebsiella pneumoniae ［J］.Bioresour Technol, 2012,103（1）：351-359.

［9］ Luo LH, Kim CH, Heo SY, et al.Production of 3-hydroxypropionic acid through propionaldehyde dehydrogenase PduPmediated biosynthetic pathway in Klebsiella pneumoniae ［J］.Bioresour Technol, 2012, 103（1）：1-6.

［10］ 張曉梅, 諸葛斌, 許正宏.產3-羥基丙酸重組菌的構建及其轉化甘油的研究［J］.生物技術通報, 2009（8）：104-108.

［11］ 黃瑞, 張曉梅.釀酒酵母乙醛脫氫酶的克隆與表達［J］.工業微生物, 2009, 1：22-27.

［12］ 黃瑞, 利用甘油發酵生產3-羥基丙酸基因工程菌的構建［D］.無錫：江南大學, 2007.

［13］ Tobimatsu T, Kajiura H, Yunoki M.Identification and expression of the genes encoding a reactivating factor for adenosylcobalamindependent glycerol dehydratase［J］.J Bacteriol, 1999, 181：4110-4113.

［14］ Toraya T, Mori KA.Reactivating factor for coenzyme B12-dependent diol dehydratase［J］.J Biol Chem, 1999, 274：3372-3377.

［15］ Zeng AP, Biebl H.Multiple product inhibition and growthmodeling of Clostridium butyricum and Klebsiella pneumoniae in glycerol fermentation ［J］.Biotechnol Bioeng, 1994, 44：902-911.