適合轉錄組測序的葡萄葉片總RNA試劑盒提取法的改進

楊曉燕 張波， 黃方愛 顏歡 李月榮 鄭秋生

從植物組織中提取RNA是進行植物分子生物學方面研究的必要前提［1］，近年來發展的高通量測序技術，如轉錄組短槍測序法（Whole Transcriptome Shotgun Sequencing）、轉錄組測序技術（RNA-Seq）和高性能的生物信息分析技術對于RNA的質量要求較高，這對RNA提取在完整性和純度方面有了更高的要求。

植物含有大量的多糖、多酚、代謝產物、色素等成分，增加了高質量RNA的提取難度；由于種屬和取材部位的不同亦會造成提取策略個體化及復雜化，適合植物RNA提取的方法也不盡相同［2-5］。葡萄組織中就有多種次生代謝產物，較難提取到高質量的RNA［6］，盡管國內外的研究者已經開發出從葡萄組織中提取 RNA 的方法，如 SDS 法［7］、CTAB 法［8，9］、以及二者結合法等方法［10］。近年來，商業化的RNA提取試劑盒在一些植物樣品RNA提取中已被證明具有簡單快捷，試驗重復性較好的優點。但對于高質量尤其是滿足測序要求的樣本，其應用效果尚待評價。為了滿足本課題對于葡萄葉片樣本RNA提取效果較高的需求，本研究擬對比3種新疆地區常見植物RNA提取試劑盒在葡萄葉片RNA提取中的效果，并針對葡萄葉片材料特性對試劑盒操作流程優化，建立適合于RNA-Seq測序的葡萄葉片高質量RNA提取方案。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為紅地球葡萄（Vitis vinifera L.cv.Red Globe）1月齡葉片，取自于石河子大學藥園。

1.2 方法

1.2.1 總RNA 的提取方法 首先通過變性劑裂解破碎組織，然后經過氯仿等有機溶劑變性蛋白并抽提RNA，最后將RNA經過沉淀、洗滌、干燥并溶解待用。1.2.2.1 試劑盒A：UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒（生工生物工程股份有限公司，上海）。試劑盒B：RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司，北京）。試劑盒C：RNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN公司，德國）步驟皆參照各自說明書。

1.2.2.2 試劑盒方法改進 參照試劑盒提供方法和流程，具體改進策略詳，見表1。

表1 三種試劑盒提取葡萄葉片總RNA的改進策略

1.2.2.3 總RNA檢測及純度分析 RNA樣品非變性瓊脂糖凝膠電泳檢測。各方法提取之RNA置于1％瓊脂糖凝膠（Biowest?regular agarose G-10，gene有限公司）上電泳，電壓120V，15min（恒流恒壓電泳儀，美國Bio-Rad公司），用凝膠成像系統（Bioshine GelX 1650凝膠成像系統，上海歐翔科學儀器有限公司）拍照記錄。

（1）濃度檢測方法：Qubit Fluorometer（美國invitrogen公司）；瓊脂糖凝膠電泳定量；Agilent 2100（美國安捷倫科技公司）。

（2）28S∶18S檢測方法：Agilent 2100（美國安捷倫公司）芯片分析儀自動計算。

1.2.2.4 基因數字表達譜測序（RNA-Seq）參考文獻［11］及華大基因委托書技術內容，試驗流程簡介如下：總RNA加熱打開二級結構后，帶有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA，用試劑盒去除rRNA。向得到的mRNA中加入適量打斷試劑高溫條件下使其片段化，再以片段后的mRNA為模板，合成cDNA，經過磁珠純化、末端修復、3'末端加堿基A、加測序接頭后，進行PCR擴增，從而完成整個文庫制備工作構建好的文庫用Agilent 2100Bioanalyzer（美國安捷倫公司）以及ABI StepOnePlus Real-Time PCR System（美國應用生物系統ABI公司）進行質量和產量檢測，文庫質控合格后使用Illumina HiSeqTM2000（美國Illumina公司）進行測序。

2 結果

2.1 RNA電泳分析

RNA質量一般通過電泳和RNA特定吸光度的值共同來評價，在圖1中對比分析了條件優化前后對試劑盒A、B、C提取結果的影響。采用試劑盒A推薦的方法提取的葡萄葉片RNA經瓊脂糖凝膠電泳后沒有條帶（優化前試劑盒A所示），優化后得到的RNA電泳條帶明顯出現，但伴隨有拖尾現象（優化后試劑盒A所示）；采用試劑盒B推薦方法提取的RNA電泳條帶只有5S帶，且有彌散現象（優化前試劑盒B所示），優化后得到清晰的28S、18S和5S電泳條帶（優化后試劑盒B所示）；采用試劑盒C推薦方法提取的RNA電泳條帶有不清晰的2個條帶，18S和5S（優化前試劑盒C所示），優化后得到清晰明亮的28S、18S和5S電泳條帶（優化后試劑盒C所示）。

2.2 RNA純度、濃度檢測

從表2可以看出采用試劑盒A（編號1、2、3）改進方法提取的RNA樣品原液濃度大于100ng，OD260/OD280在1.8-2.2之間，但是OD260/OD230均小于2。而采用試劑盒B（編號4、5、6）和試劑盒C（編號7、8、9）改進方法提取的6個RNA樣品不但原液濃度大于100ng，而且OD260/OD280和OD260/OD230的值全都在1.8-2.2之間。為了保證后續試驗的準確性，試驗又采用Agilent 2100對3個試劑盒改進法提取的RNA樣品純度和質量進行深度分析，檢測結果見圖2。

圖1 三種試劑盒方法提取葡萄葉片總RNA電泳圖

通過Agilent 2100RNA芯片對提取的總RNA電泳結果質量檢測，試劑盒A改進方法提取的1號RNA樣品總范圍為151.2，濃度為117ng/μL，RNA完整性為8.10；2號RNA樣品總范圍為155.2，濃度為88ng/μL，RNA完整性為8.50；3號RNA樣品總范圍為103.9，濃度為99ng/μL，RNA完整性為8.40；試劑盒B改進方法提取的4號RNA樣品總范圍為155.4，濃度為110ng/μL，RNA完整性為8.60；5號RNA樣品總范圍為136.7，濃度為97ng /μL，RNA完整性為8.00；6號RNA樣品總范圍為91.4，濃度為65ng/μL，RNA完整性為8.40；試劑盒C改進方法提取的7號RNA樣品總范圍為485.2，濃度為199ng/μL，RNA完整性為8.00；8號RNA樣品總范圍為328.7，濃度為135ng/μL，RNA完整性為8.50；9號RNA樣品總范圍為505.5，濃度為190ng/μL，RNA完整性為7.40。

表2 Qubit Fluorometer 檢測3種試劑盒改進方法提取的葡萄葉片總RNA純度及產量

從表3中可以看出，采用Agilent 2100RNA芯片檢測3個試劑盒改進方法提取的9個RNA樣品28S條帶大小是18S的1.5-2.0倍。

2.3 RNA測序質量評估

隨機選取試劑盒B和試劑盒C改進方法提取的3個RNA樣品進行基因數字表達譜測序（RNA-Seq）工作。結果如圖3所示，A、B、C 3個測序樣品的片段可讀性（Tags distribution）滿足RNA-Seq分析要求，其中完全測序（Clean reads）在A與C樣品超過了99％。此外，Containing adaptor是處理后依然含有標簽序列的基因，Containing N是含有未知核苷酸的基因，Low quality是測序堿基峰值小于檢測閾值的基因，這些都屬于低質量測序結果標志。從圖3中可以看到，樣品中上述低質量測序結果所占比重極小，說明經優化的試劑盒提取的RNA的質量是可以滿足測序要求的。

圖2 Agilent 2100 RNA芯片對提取的總RNA電泳結果質量

表3 Agilent 2100 RNA芯片檢測提取總RNA質量

圖3 測序樣品的Tag分布統計（n=3）

2.4 RNA測序基因覆蓋度

根據RNA-Seq的測序技術原理，在樣本的測序過程中，對目的基因在測序結果的覆蓋程度及這些基因數目進行RNA測序基因覆蓋度分析。從圖4中可以看出，覆蓋度在60％以上的基因數占總基因數的比例A是47.76％，B是51.42％，C是55.48％。覆蓋度＞90％的基因數占總基因數的比例A是18.76％，B是20.46％，C是22.98％，這些結果表明，所獲得RNA的測序結果基因覆蓋度較高，達到了RNA-Seq分析的基本要求。

圖4 RNA測序基因覆蓋度統計

3 討論

高性能的RNA生物信息學研究在樣品完整性和純度方面對RNA提取技術有特殊的要求。相對于常規提取，樣品完整且無酶等抑制物殘留成為商品化的RNA提取試劑盒的基本技術指標。實際使用過程中，提取策略往往需要針對具體樣品特點進行條件優化，延長接觸時間是若干優化中最經濟的一種。本研究即針對葡萄葉樣本進行提取策略的優化，如表1所示適當延長提取環節相關試劑與樣品的接觸時間，可以在不增加提取成本的情況下顯著提升3種試劑盒的提取效果。

Trizol交換柱法是動植物細胞RNA提取最常見試劑盒提取方法，適用面廣且操作簡便，但在本研究中發現Trizol法RNA提取試劑盒A即使優化后條件也無法滿足本試驗提取質量要求，這說明針對葡萄葉樣品不建議使用這類寬泛型試劑盒。試劑盒B和C主要針對植物樣品，在優化時間等條件后，B的電泳條帶28S和18S條帶清晰明亮，C的可以看到清晰的3條電泳條帶，提示提取的RNA完整性較好，說明適合葡萄葉樣品提取。

分子生物學試驗中對RNA質控一般通過樣品吸光值比率進行純度評估，OD260/OD280的比值用于估計核酸的純度（1.8-2.2）。但對于RNA-Seq需要額外OD260/OD230比值用于估計脫鹽和去多糖多酚的程度（＞2.0）［12，13］，蛋白去除不徹底會導致前者比值過低，脫鹽不完全或植物多糖與多酚的污染會導致后者比值過低［14］，這兩種指標是保障高質量RNA提取的重要判定標準。譬如試劑盒A改進后3個RNA提取樣品OD260/OD280值在1.8-2.2之間，但是OD260/OD230都小于2，這種純度的RNA可以滿足RT-PCR試驗需求，但無法保障RNA-Seq要求。而專門針對植物材料的試劑盒B和試劑盒C在優化試驗中取得了較理想的提取結果，通過Agilent 2100對樣品純度和完整性進行深度分析發現采用改進方法試劑盒B提取的RNA的28S∶18S的值都接近2，說明試劑盒B優化后提取的RNA質量最佳。數字基因表達譜需要高純度和高完整性的RNA樣本，對比參考文獻［15，16］中數字基因表達譜（RNA-Seq）中RNA測序質量評估和RNA測序基因覆蓋度的結果，本試驗結果表明試劑盒B、C經優化條件后提取的葡萄葉片RNA滿足cDNA文庫構建及RNA表達譜測序的工作需求。

4 結論

寬泛的Trizol提取法并不適合葡萄葉樣品高質量RNA提取。即便是專門針對植物樣品的試劑盒其參數也需要根據具體樣品特點進行優化，推薦延長試劑與提取樣品接觸時間。

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