山藥多糖預處理對大鼠腎缺血再灌注損傷的抗氧化保護作用

唐 群 吳 華 雷久士

1.湖南中醫藥大學病理教研室，湖南長沙 410208；2.湖南省第二人民醫院芙蓉司法鑒定中心，湖南長沙 410007

腎缺血再灌注損傷 （renal ischemia reperfusion injury，RIRI）是臨床上經常遇到的問題。腎是高灌注器官，對缺血缺氧比較敏感，因此，如何降低由于RIRI 所引起的腎損害，促進恢復已成為一個重要的研究課題。急性RIRI 與氧自由基關系密切[1-2]，再灌注引起的氧自由基大量生成而引發的脂質過氧化作用，激發了腎小管上皮細胞的凋亡及壞死[3]，從而影響患者腎功能的恢復。山藥多糖是山藥的主要活性成分，已有研究證明，山藥多糖具有較強的抗氧化活性作用[4-5]，但其防治RIRI 方面未見報道。本實驗通過復制大鼠RIRI 模型，探討山藥多糖對RIRI 腎功能的影響及其保護機制，為臨床用藥提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物SPF級雄性 SD大鼠30只，體重（200±20）g，由湖南中醫藥大學實驗動物中心提供并飼養于湖南中醫藥大學SPF級動物房，動物合格證號：SCXK（湘）2009-0001。

1.1.2 試劑 谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）試劑盒購自南京建成生物工程研究所，其余試劑均為國產分析純。

1.1.3 藥物制備 淮山藥購自湖南中醫藥大學第一附屬醫院藥劑科。干山藥片洗凈加雙蒸水置40℃浸泡4 h，用勻漿器勻漿，按1∶8 加雙蒸水40℃提取2 h，用4 層紗布過濾冷卻后取上清4000 r/min 離心10 min 去雜質，于80℃濃縮，加乙醇濃度至80%時多糖析出，靜置后出現沉淀，4000 r/min離心10 min，回收乙醇，沉淀用無水乙醇提取3次，冷凍干燥后為灰白色山藥粗多糖，用蒽酮法測定山藥多糖的含量為18%。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 將大鼠隨機均分為3 組，每組10 只：①假手術組：麻醉后開腹，分離雙側腎蒂暴露60 min 后關閉腹腔。②腎缺血再灌注組：復制RIRI 模型[6]。③山藥多糖預處理組：復制RIRI 模型。術前1周，山藥多糖預處理組以200 mg/kg 山藥多糖灌胃，假手術組和腎缺血再灌注組以等容量生理鹽水灌胃，1次/d。

1.2.2 復制腎缺血-再灌注損傷模型 術前12 h 禁食，自由飲水，腹腔注射1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉，切除右側腎臟，以避免右側腎臟的代償作用，暴露左側腎臟并游離腎蒂，夾閉腎動靜脈60 min，松開動脈夾后，如果腎臟由紫黑色轉為紅色說明腎缺血-再灌注模型復制成功，如果松開動脈夾5 min 后未變成紅色，說明灌注不成功，棄去不用。再灌注6 h 后處死動物。

1.2.3 血清尿素氮、血清肌酐測定 各組大鼠在再灌注6 h后分別于腹主動脈取血3 mL，3000 r/min 離心15 min 后分離血清，分裝后-70℃冰箱保存待測。血清肌酐（Scr）測定采用堿性苦味酸比色法，血清尿素氮（BUN）測定采用二乙酰一肟顯色法。

1.2.4 腎組織SOD、GSH-Px 活性及MDA 含量測定 大鼠處死后取腎組織置于勻漿器中，按重量體積比加入9倍的生理鹽水制備成10%的腎組織勻漿，立即放入-20℃冰箱中保存。按照南京建成生物工程研究所提供的試劑盒說明書測定腎組織SOD、GSH-Px 活性及MDA 含量。

1.3 統計學方法

采用SPSS 19.0 統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組血清BUN、Scr 含量比較

與假手術組比較，腎缺血再灌注組血清BUN、Scr 含量明顯升高（P<0.01）；與腎缺血再灌注組比較，山藥多糖預處理組血清BUN、Scr 含量明顯降低（P<0.01），見表1。

表1 山藥多糖預處理對大鼠腎缺血再灌注血清BUN、SCr含量的影響（±s，n=10）

表1 山藥多糖預處理對大鼠腎缺血再灌注血清BUN、SCr含量的影響（±s，n=10）

注：與假手術組比較，**P＜0.01；與腎缺血再灌注組比較，△△P＜0.01；BUN：尿素氮；SCr：血清肌酐

組別 BUN（mmol/L） SCr（μmol/L）假手術組腎缺血再灌注組山藥多糖預處理組7.94±0.48 14.45±1.65**11.32±1.04**△△51.62±4.27 162.42±12.58**125.74±9.89**△△

2.2 各組腎組織SOD、GSH-Px 活性及MDA 含量比較

與假手術組比較，腎缺血再灌注組MDA 含量明顯升高（P<0.01），SOD、GSH-Px 活性明顯下降（P<0.01）；與腎缺血再灌注組比較，山藥多糖預處理組MDA 含量明顯下降（P<0.01），SOD、GSH-Px 活性明顯升高（P<0.01）。見表2。

表2 山藥多糖預處理對大鼠腎缺血再灌注組織SOD、GSH-Px 活性及 MDA 含量的影響（±s，n=10）

表2 山藥多糖預處理對大鼠腎缺血再灌注組織SOD、GSH-Px 活性及 MDA 含量的影響（±s，n=10）

注：與假手術組比較，**P＜0.01；與腎缺血再灌注組比較，△△P＜0.01；SOD：超氧化物歧化酶；GSH-Px：谷胱甘肽過氧化物酶；MDA：丙二醛

組別 SOD（U/mg） GSH-Px（U/mg） MDA（nmol/mg）假手術組腎缺血再灌注組山藥多糖預處理組54.24±4.58 28.36±2.46**39.21±2.89**△△187.94±10.48 142.41±8.55**169.38±8.54**△△2.24±0.34 6.58±0.56**4.74±0.49**△△

3 討論

缺血再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury，IRI）是指組織器官在缺血的基礎上恢復血流后組織損傷反而加重，甚至發生不可逆性損傷的現象[7]。腎臟血流量豐富，是對IRI 敏感的器官之一，臨床上休克、彌散性血管內凝血、腎臟外傷和腎臟移植中均可發生RIRI。山藥原名薯蕷，始載于漢代《神農本草經》，為健脾補腎藥?，F代的研究表明，山藥多糖是山藥的主要活性成分，主要由甘露糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖組成，具有增強免疫、抗氧化、延緩衰老、抗腫瘤、降低血糖等多種藥理作用[8-9]。目前有關山藥多糖防治RIRI 未見報道，但其具有較強的抗氧化作用已為眾多研究所證實。因此，有關山藥多糖抗氧化作用對IRI后腎臟的保護作用值得探討和研究。

BUN、SCr 是臨床上評價腎功能的常用指標。BUN 是人體蛋白質代謝的主要終末產物，SCr人體肌肉代謝的產物，兩者主要經血循環從腎臟排除體外，其血中的濃度取決于腎小球濾過能力，當腎實質受到損傷，腎小球濾過率下降至一定程度，血清BUN、SCr 的濃度就會明顯上升。腎缺血再灌注時，BUN、SCr 濃度明顯增高，表明腎功能嚴重受損。本實驗結果表明：假手術組BUN、SCr 未見明顯升高，排除了手術因素造成的腎功能變化。與假手術組比較，腎缺血再灌注組血清BUN、SCr 含量明顯升高，表明腎功能嚴重受損，實驗造模成功。這與曹譯心等[10]的研究一致。與腎缺血再灌注組比較，山藥多糖預處理組血清BUN、SCr 含量明顯降低且差異有高度統計學意義（P<0.01），說明山藥多糖能改善腎功能，對RIRI 的腎臟損傷有顯著的保護作用。

IRI 與氧自由基的大量產生密切相關[11]，SOD 和GSH-Px是體內抗氧化系統重要組成部分[12]。SOD 主要通過歧化反應清除過氧化氫和超氧陰離子，從而保護細胞免受毒性氧自由基的損傷。GSH-Px 可催化有毒的過氧化氫分解為水和氧，對于保護細胞的膜相結構和各種生物大分子起重要作用。MDA 是自由基攻擊細胞膜的不飽和脂肪酸，引起脂質過氧化反應生成的毒性產物，對機體易造成損害。本實驗結果表明：與假手術組相比較，腎缺血再灌注組SOD、GSH-Px 活性明顯下降，MDA 含量升高，表明機體抗氧化酶的活性明顯下降，毒性產物增加；與腎缺血再灌注組比較，山藥多糖預處理組SOD、GSH-Px 活性明顯升高，MDA含量下降且差異有高度統計學意義（P<0.01），說明山藥多糖能改善體內的抗氧化系統，減少毒性產物，從而發揮對腎缺血再灌注組的腎臟保護作用。

綜上所述，山藥多糖預處理在腎缺血再灌注損傷中可顯著改善腎功能，其保護機制與其抗氧化作用有關，這對防治腎缺血再灌注損傷具有重要的研究意義，可為臨床腎缺血再灌注損傷的防治開辟新途徑。

[1]Shingu C，Koga H，Hagiwara S，et al.Hydrogen-rich saline solution attenuates renal ischemia-reperfusion injury [J].J Anesth，2010，24（4）：569-574.

[2]Koga H，Hagiwara S，Kusaka J，et al.New α-lipoic acid derivative，DHL-HisZn，ameliorates renal ischemia-reperfusion injury in rats[J].J Surg Res，2012，174（2）：352-358.

[3]Jeong JW，Jin CY，Park C，et al.Induction of apoptosis by cordycepin via reactive oxygen species generation in human leukemia cells[J].Toxicol In Vitro，2011，25（4）：817-824.

[4]王麗霞，劉安軍，舒媛，等.山藥蛋白多糖體外抗氧化作用的研究[J].現代生物醫學進展，2008，8（2）：242-245.

[5]申森，陳志冉，樊欣.山藥多糖的提取工藝及抗氧化活性研究[J].安徽農業科學，2012，40（20）：10581-10582，1058.

[6]王蕾，買買提祖農·買蘇爾，克拉拉·阿巴斯，等.葡萄籽原花青素對大鼠腎缺血再灌注損傷保護作用的研究[J].新疆醫科大學學報，2011，34（1）：58-61.

[7]劉靈芝.巴戟天醇提物對離體大鼠缺血再灌注損傷心肌能量代謝的影響[J].中國醫藥導報，2012，9（28）：10-11，17.

[8]張紅英，趙現敏，崔保安.山藥多糖研究進展[J]河南中醫學院學報，2006，21（6）：87-88.

[9]楊宏莉，李少春，張偉偉，等.山藥多糖的藥理作用[J].醫學研究與教育，2010，27（3）：80-82.

[10]曹譯心，張旭，張翠薇.紅花提取物對腎缺血再灌注損傷的影響[J].中國醫藥導報，2011，8（25）：26-28.

[11]譚安雄，朱耀斌，李小云.芒果苷對腦缺血再灌注大鼠抗氧化系統的影響[J].時珍國醫國藥，2012，23（1）：161-162.

[12]Atilgan D，Parlaktas BS，Uluocak N，et al.Effects of melatonin on partial unilateral ureteral obstruction induced oxidative injury in rat kidney[J].Urol Ann，2012，4（2）：89-93.