MicroRNA-29b在動脈粥樣硬化血管中的表達

伍韻賢 曾昭華 蘇子焯 劉寶驊 杜一鵬 梁麗英

1.廣州醫學院第一附屬醫院心血管內科，廣東廣州 510375；2.廣東省廣州市海珠區石溪中醫醫院內科，廣東廣州 510375

MicroRNA-29（miR-29）是新近發現的一類小分子RNA家族，能識別特定的mRNA，并在轉錄后水平負性調控靶基因的表達[1]。MiR-29可通過直接抑制多種細胞外基質蛋白表達和調控多種與纖維化相關的信號通路參與纖維化的過程[2]。miR-29 包括 miR-29a，miR-29b 和 miR-29c，本實驗通過觀察Apo-E（-/-）小鼠主動脈根部血管miR-29b表達情況，了解miR-29b與動脈粥樣硬化斑塊形成過程的相關性。

1 材料與方法

1.1 動脈粥樣硬化動物模型建立

實驗組（FS 組）：8 只，雄性，體重在 18～22 g，5 周齡，SPF級載脂蛋白E基因敲除（C57BL/6J-ApoE）小鼠。對照組（NS組）：8只，雄性，相同體重范圍及相同周齡的SPF級C57BL/6J小鼠。實驗用小鼠均購自北京大學動物中心，在廣州呼吸疾病研究所國家重點實驗室的SPF級動物房飼養。高脂喂食15周（1%膽固醇+15%豬油），飲用水為蒸餾水，飲水及飼料不限。飼養室溫保持在18～20℃，環境相對濕度40%～70%。小鼠20周齡取材。

測體重，取血測總膽固醇（total cholesterol，TC），預測模型組TC水平比正常對照組高6～10倍時，模型建立可能成功。遂取血管標本觀察有無動脈粥樣硬化斑塊形成，以確定模型建立是否成功。如無明顯動脈粥樣硬化斑塊形成，則繼續高脂飼養周數，直到動脈粥樣硬化模型預評達標。

1.2 血管標本及血清的取材

1.2.1 摘除眼球法取血 1%戊巴比妥鈉0.1 mL/kg，腹腔注射麻醉。待小鼠翻身反應消失，摘除眼球，將血液滴入含10%EDTA及抑肽酶的抗凝管內。取血約1 mL。血液離心（3000 r/min，10 min）后，取血清至 Eppendorf管。

1.2.2 血管標本的提取 取血完成后，使用手術剪剪開小鼠胸腔及腹腔。暴露心臟，在右心房剪1小口，用注射器穿入左心室，給予冰凍生理鹽水緩慢輸注灌洗，至肝臟及心肌顏色變白，右心房流出的液體基本變清亮為止。打開胸、腹腔，去除肺臟及腹腔內器官。分離胸主動脈和腹主動脈血管全程，剪取主動脈并以冰凍生理鹽水沖洗。每組小鼠取1根完整血管標本縱向剖開，并染色，以觀察血管整體改變；其余全部血管置于-80℃冰箱中保存。

1.3 血脂水平的測定

將取材后血清送廣州醫學院第一附屬醫院檢驗科，用全自動生化分析儀檢測TC含量。

1.4 主動脈血管壁MiR-29b的表達

取出-80℃保存的主動脈，應用熒光定量PCR技術，檢測血管的miR-29b表達。

1.5 統計學方法

采用軟件SPSS 17.0進行統計學分分析。計量資料數據以均數±標準差（±s）表示，比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 載脂蛋白E基因敲除小鼠動脈粥樣硬化模型的評估

高脂飼養15周后，兩組指標的比較如下：FS組和NS組體重[（29.10±2.53）g 和（33.20±5.18）g]無明顯差異（P ＞0.05）；FS 組較 NS 組血清 TC[（13.52±1.58）mmol/L 和（2.12±0.35）mmol/L]顯著增高（P ＜ 0.01）。 見表 1。

表1 動脈粥樣硬化動物模型的一般指標比較（±s）

表1 動脈粥樣硬化動物模型的一般指標比較（±s）

注：與NS組比較，*P<0.01

FS組（n=8）NS 組（n=8）29.10±2.53*13.52±1.58 33.20±5.18 2.12±0.35組別 體重（g） 總膽固醇（mmol/L）

2.2 血管內膜病理肉眼改變

剖開主動脈弓可見：FS組內膜面有淡黃色斑塊狀隆起，散在或融合成片，其長軸多與血管長軸平行，病變最明顯在血管分叉處；NS組，血管內膜光滑、平整，無脂質沉積。

2.3 蘇丹Ⅳ染色

FS組：主動脈內膜肉眼所見斑塊狀隆起處被染成猩紅色，整個被蘇丹Ⅳ染色部分呈片狀分布，與內膜正常部分紅白分明；NS組血管內膜光滑，幾乎不存在任何紅染，呈現內膜本色（白色）。見圖1。

2.4 HE染色

圖1 主動脈蘇丹Ⅳ染色

FS組：主動脈血管內膜明顯增厚，呈圓弧狀或新月狀凸起；可見大量胞漿內含有大量脂質空泡的泡沫細胞形成；內彈性膜被破壞；中膜平滑肌增生明顯且不規則排列；NS組，主動脈血管壁分層清晰，血管內膜完整、光滑、無增厚；內皮下無脂質沉積；中膜平滑肌細胞規則整齊排列。見圖2。

以上指標顯示該Apo-E基因敲除小鼠動脈粥樣硬化模型構建成功。

2.5 主動脈血管壁miR-29b的表達

FS組主動脈弓miR-29b的表達較NS組明顯降低[平均吸光度值：（2.10±0.27）和（17.56±1.07）]明顯降低（P<0.01），提示在動脈粥樣硬化模型主動脈中存在miR-29b的低表達。

3 討論

可能與心血管事件發生有密切相關的miRNAs目前證 實 有 ：miR-1、miR-126、miR-199、miR-29b、miR-30、miR-133等。MiR-29是新近發現的一類與纖維化疾病密切相關的小分子RNA家族。人類的miR-29的家族擁有3個成熟成員，分別為miR-29a、miR-29b和 miR-29c。MiR-29b含兩個基因編碼簇，其直接目標至少有16個細胞外基質基因。miR-29b與促細胞分化和凋亡的調控[3-4]、心肌肥厚[5]的發生、發展密切相關。Van Rooij等[6]指出，miR-29家族對急性心肌梗死后心肌組織纖維化的mRNA編碼，如：膠原蛋白、纖維蛋白等細胞外基質蛋白和彈性蛋白起抑制調控作用。Boon等[2]指出，miR-29可通過直接抑制多種細胞外基質蛋白表達和調控多種與纖維化相關的信號通路參與纖維化過程。在小鼠和人類動脈中，血管老化及年齡相關病變引起miR-29家族的顯著上調。

本實驗在Apo-E基因敲除小鼠主動脈中，采取逆轉錄酶聚合酶鏈技術對miR-29b的表達進行研究。結果顯示，在高脂飼養的Apo-E基因敲除小鼠的主動脈中，形成典型的動脈粥樣硬化斑塊；動脈粥樣硬化血管中miR-29b表達減少，與血管壁老化導致miR-29b表達上升[2]相反。提示可能miR-29b對血管壁局部負性調控減弱，有利于動脈粥樣硬化的形成；或者是動脈粥樣硬化形成后產生對miR-29b表達的抑制所導致。

筆者推測在高脂喂食的Apo-E基因敲除小鼠動脈粥樣硬化模型中，miR-29b低表達可能與動脈粥樣硬化斑塊的形成有關。

[1]Ambros V.MicroRNA pathways in flies and worms：growth，death，fat，stress，and timing[J].Cell，2003，113（6）：673-676.

[2]Boon RA，Seeger T，Hevdt S，et al.MicroRNA-29 in aortic dilation：implications for aneurysm formation[J].Circ Res，2011，109（10）：1115-1119.

[3]Kriegel AJ，Liu Y，Fang Y，et al.The miR-29 family：genomics，cell biology，and relevance to renal and cardiovascular injury [J].Physiol Genomics，2012，44（4）：237-244.

[4]Chen KC，Wang YS，Hu CY，et al.OxLDL up-regulates microRNA-29b，leading to epigenetic modifications of MMP-2/MMP-9 genes：a novel mechanism for cardiovascular diseases[J].Faseb J，2011，5（5）：1718-1728.

[5]Cheng Y，Ji R，Yue J，et al.MicroRNAs are aberrantly expressed in hypertrophic heart：do they play a role in cardiac hypertrophy[J].Am J Pathol，2007，170（6）：1831-1840.

[6]Van Rooij E，Sutherland LB，Thatcher JE，et al.Dysregulation of microRNAs after myocardial infarction reveals a role of miR-29 in cardiac fibrosis[J].Proc Natl Acad Sci USA，2008，105（35）：13027-13032.