不同運動強度影響大鼠腦缺血后神經功能修復機制的研究

吳偉奮 陳春美 蘇德炎 高松齡 陳慶熙 韋 浩 王春華 楊衛忠

1.福建醫科大學體育教研部，福建福州 350108；2.福建醫科大學附屬協和醫院神經外科，福建福州 350001

運動療法在腦梗死、偏癱康復治療一直在運動醫學界引起廣泛關注。前期研究證實，腦梗死后出現的神經功能損失與一氧化氮（NO）和一氧化氮合酶（NOS）的表達有關[1-2]。研究腦缺血偏癱機制和治療的經典動物模型是大鼠局灶性腦缺血模型，本研究采用線栓法閉塞大鼠右側大腦中動脈法（middle cerebral artery occlusion，MACO）建立局灶性腦缺血大鼠模型，其目的在于探討有氧運動促進減少神經功能缺失和腦缺血后神經細胞修復的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

24 只健康成年雄性 SD 大鼠，體重（260±10）g，清潔級，來自浙江省實驗動物中心，標準嚙齒類飼料飼養且自由飲食，室內溫度控制在20～24℃。

1.2 局灶性腦缺血大鼠模型的建立

大鼠分籠飼養，待其適應1周后，腹腔注射麻醉（2%戊巴比妥鈉：35 mg/kg），參照Longa等[3]學者應用線栓法閉塞大鼠右側大腦中動脈建立腦缺血大鼠模型。將其隨機分為對照組、疲勞運動組和有氧運動組，各組8只。

1.3 運動方式

有氧運動組和疲勞運動組均采用遞增強度方式進行跑臺運動，運動負荷參照Bedford等[4]的研究進行，有氧訓練組每周5 d，共4周，起始速度為15 m/min，時間為20 min，遞增速度3 m/min、時間5 min，運動至速度為20 m/min，時間為60 min后增加跑臺坡度5%；疲勞訓練組每周6 d，共4周，遞增速度3 m/min、時間5 min，運動至速度為35 m/min，時間為（60±10）min后增加跑臺坡度10%；對照組正常籠內喂養，不運動。

1.4 神經功能缺失評分

在規定的時間點時對每只大鼠進行神經功能缺失評分，評分參考 Longa等[3]的方法，評分標準是：0分，沒有神經損傷癥狀；1分，不能完全伸展對側前爪；2分，向外側（左）轉圈；3分，向對側傾倒；4分，不能自發行走，意識喪失。

1.5 腦組織標本制作

在規定的時間點對每只造模成功的大鼠進行深度麻醉，然后用生理鹽水快速沖洗主動脈后，剪開大鼠頭部并暴露腦組織，快速把腦組織取出，然后包埋在冰中，在大鼠右側離額極2.5 mm處（右側額頂葉背外側皮質和基底節）向后切取，稱重后，并按0.1 g每份分成數個等份，把其中的一份迅速置于電鏡固定液，剩余的-70℃冰箱保存，留著備用。

1.6 透射電鏡觀察腦缺血對腦組織結構的影響

隨機從各組腦組織標本中各選取一份，用3%戊二醛-1.5%多聚甲醛前固定，1%鋨酸-1.5%亞鐵氰化鉀進行后固定，然后用酒精-丙酮進行脫水，用環氧樹脂618包埋劑進行包埋；切成超薄切片，用醋酸鈾、檸檬酸鉛對其進行染色，最后應用日立Hu-12A型（飛利浦208型）透射電鏡進行觀察、拍照。

1.7 腦組織NO含量和NOS活性的測定

隨機從各組腦組織各選取一份標本，標本上的血液用4℃預冷的生理鹽水洗凈，0.1 g勻漿，離心 10 min（4000 r/min），把分離得到的上清液分別用于NOS活性和NO含量的測定，按試劑盒說明書上的操作步驟進行操作。從武漢博士德試劑公司采購的NO硝酸還原酶法測定試劑盒，從南京建成生物工程公司采購的NOS活性測定試劑盒。

1.8 RT-PCR半定量分析eNOS、nNOS和iNOS基因在腦組織中的表達特點

從各組腦組織標本中各隨機抽取一份，RNA用Trizol試劑抽提，并計算總RNA濃度，稱重2 μg總RNA進行逆轉錄，再將2 μL的逆轉錄反應液作為模板，并在其中加入引物（β-actin，內參照）進行 PCR擴增，總反應體積 50 μL。選用的引物分別為eNOS（F5′-AGAGCATACCCGCACTTCTG-3′；R5′-GGAAGTAAGTGAGAGCCTGG-3′），nNOS （F5′-ACAAAGGAATGAATCCGTGCC-3′；R5′-GGCAGGAGGATCCAGTTAG-GA-3′），iNOS （F5′-CACGGAGAACAGCAGAGTTGG-3′；R5′-TTGTGGTGAAGGGTGTCGTG-3′），β-actin（F5′-CAGAGCAAGAGAGGCATCCT-3′；R5′-GGATAGCACAGCCTAGATAG-3′）。 擴增條件：先用高溫94℃預變性5 min，然后94℃變性30 s，接著按（eNOS：58℃；nNOS：55℃；iNOS：55℃）復性 30 s，72℃延伸1 min（上述各步驟循環35次），最后72℃繼續延伸7 min。用1.8%瓊脂糖凝膠電泳和美國伯樂BIO－RAD Gel DocTMXR凝膠成像系統對PCR產物進行觀察和照相，獨立重復4次實驗，并用β-actin內參照作為內標，然后與同步產物進行比較，定量PCR產物，應用Quantity-one分析軟件進行半定量分析，該基因mRNA的水平是通過計算所得產物的積分光密度與各自內參照積分光密度的比值來反映的。

1.9 統計學方法

采用統計軟件SPSS 13.0對實驗數據進行分析，計量資料數據以均數±標準差（±s）表示，采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 神經功能缺失評分

對照組、有氧運動組和疲勞運動組的神經功能缺失評分分別為（1.64±0.25）、（0.75±0.15）分和（2.85±0.33）分，三組之間差異有統計學意義（P<0.05）。

2.2 透視電鏡觀察腦組織超微結構

對照組（圖1）的細胞形態及細胞核不規則；有氧運動組（圖2）細胞形態和細胞核不僅規則，而且細胞表面微絨毛豐富，線粒體、內質網和溶酶體等細胞器也增多；疲勞運動組（圖3）細胞核分裂，細胞質中可見線粒體腫脹明顯，甚至產生空泡狀變。

2.3 腦組織NO含量和NOS活性的測定結果

有氧運動組NO含量和NOS的活性均高于對照組，但低于疲勞運動組，三組之間差異均有高度統計學意義（P<0.01）。 見表1。

表1 各組腦組織NO含量和NOS活性的變化（±s）

表1 各組腦組織NO含量和NOS活性的變化（±s）

注：與對照組比較，t=15.179，*P<0.01，t＝ 7.060，△P<0.01；與有氧運動組比較，t＝ 21.503，▲P<0.01，t＝ 16.667，#P<0.01

對照組有氧運動組疲勞運動組888 0.27±0.01 0.39±0.02*0.56±0.03▲0.44±0.02 0.53±0.03△0.78±0.03#組別 例數 NO含量變化（μmol/g） NOS活性 （nmol/min）

2.4 RT-PCR半定量分析NOS基因結果

各小組腦組織標本提取的總RNA λ值（OD260/OD280）在1.80～1.97之間，凝膠電泳圖顯示RNA沒有降解，RT-PCR產物的電泳完后，結果顯示eNOS、iNOS、nNOS和內參照β-actin的特異性片段大小分別為625、342、501 bp和250 bp，三種NOS基因與內參照比值在各小組之間表達不一：有氧運動組與對照組比較，差異有高度統計學意義（P<0.01）；疲勞運動組與有氧運動組比較，差異有高度統計學意義（P<0.01），三組之間差異均有統計學意義，說明隨著運動量的增加，NOS基因的表達量也隨之增加。見表2。

表2 各組腦組織NOS基因表達變化（±s）

表2 各組腦組織NOS基因表達變化（±s）

注： 與對照組比較，t=10.119， ①P<0.01，t＝24.000， ②P<0.01，t=4.707， ③P<0.01，t＝ 12.649， ④P<0.01，t=12.522， ⑤P<0.01，t＝16.282， ⑥P<0.01； 與 有 氧 運 動 組 比 較 ，t ＝ 14.000，1）P<0.01，t ＝2.000，2）P<0.01，t＝13.131，3）P<0.01

對照組有氧運動組疲勞運動組888 0.19±0.01 0.43±0.02①0.29±0.02④1）0.21±0.01 0.32±0.03②0.35±0.03⑤2）0.37±0.02 0.43±0.02③0.68±0.05⑥3）組別 例數 eNOS nNOS iNOS

3 討論

缺血性腦損傷是目前發病率、致殘率和病死率均較高的嚴重疾病之一，約占全部腦血管病的80%，腦缺血疾病常常出現肢體偏癱等并發癥，如何改善腦缺血疾病的并發癥成為運動醫學和康復醫學的研究熱門課題之一。同時，建立一種生理指標控制嚴格、操作簡便、穩定可靠且重復性好、與人類腦缺血病理過程相似的理想腦缺血動物模型，對腦缺血病理機制和治療的研究至關重要。缺血性腦血管病中由大腦中動脈閉塞（MCAO）引起者占絕大多數，所以，大腦中動脈閉塞所致局灶性腦缺血模型的研究也是學者們研究的重點。由于Longa線栓法具有創傷小、不開顱、模型成功率高、偏癱癥狀接近臨床等特點，是目前應用最廣泛的腦缺血動物模型方法[3]。本實驗采用Longa線栓法建立的大鼠局灶性腦缺血模型后，大鼠具有以下癥狀：手術對側以前肢為主的偏癱；手術側眼球內陷，瞳孔縮小，眼裂變小；術后大鼠運動時身體向對側旋轉，靜止后尾巴呈特殊的盤繞狀及體重下降等現象。這些癥狀的出現標志著成功建立了大鼠局灶性腦缺血模型，這是由于MCA供血區（包括頸上交感神經通路和肌力及肌緊張的皮質高級控制區）被阻塞，因此，大腦右側中動脈阻塞就出現上述相應癥狀。同時，跑臺運動訓練是腦缺血大鼠康復治療重要的實驗研究手段，大鼠跑臺運動訓練方式的優點主要有以下幾點：①運動方式符合大鼠日常的運動情況；②大鼠在各自的通道內進行獨立運動，不會彼此干擾，使彼此之間的影響因素較少；③與游泳、運動轉鼓、跳臺等運動方式相比，跑臺運動可以更加精確地調控大鼠運動負荷、跑臺坡度和速度等。所以，本實驗研究選擇了跑臺運動訓練作為大鼠的運動方式。

NO為體內重要的信使分子和效應分子，與血管平滑肌舒張、心血管功能和神經系統的病理和生理等過程密切相關[5-6]。NO在腦缺血中的病理生理作用主要包括NO的神經保護作用和NO的神經毒性作用。NO的神經保護作用主要是通過增加腦血流、抗血小板和白細胞聚集黏附、增強突觸傳遞、阻斷N-甲基-D-天門冬氨酸 （NMDA）受體、抑制內皮素（ET）生成以及神經元對NOS的負反饋調節等機制起到對腦神經的保護作用。腦缺血時生成過量的興奮性氨基酸（如谷氨酸），過度刺激NMDA受體，使細胞膜對Ca2+的通透性增加，胞內鈣離子超載，進而引發一系列反應，最終導致神經元壞死；同時鈣離子超載又激活磷脂酶、蛋白酶及NOS等多種酶，使NOS神經元產生過量的NO，大量的NO又激活NMDA受體，使鈣離子通道活化，細胞外鈣離子涌入細胞內，進一步加重神經元損害[7]。此外，在腦缺血條件下，過量的NO還可以通過生成自由基、損傷線粒體等途徑發揮神經毒性作用。NOS是NO合成的限速酶，是調節NO的最重要環節。NOS有3種類型[8]：內皮細胞型一氧化氮合酶（endothelial NOS，eNOS）、神經元型一氧化氮合酶（neuronal NOS，nNOS）和誘導型一氧化氮合酶（inducible NOS，iNOS）。NO的雙重作用在腦缺血時比較短暫，以eNOS的表達為主，由血管內皮細胞分泌eNOS而合成的NO，所產生的NO通過擴張腦血管，增加腦血流量，抑制血小板和白細胞聚集黏附，起到腦保護作用；而在腦缺血的中晚期，nNOS、iNOS起主要作用，通過介導谷氨酸毒性，生成氧自由基，影響細胞線粒體功能，增加炎癥反應，誘導細胞凋亡等途徑產生神經毒性，nNOS表達量不高，而由梗死灶內的吞噬細胞、炎癥細胞誘導所產生的iNOS，可以通過NOS、Caspase-3和p38MAPK等基因的相互關系介導神經細胞凋亡，最終導致神經功能缺失[2，7，9]。

研究證實，運動訓練能夠改善腦缺血患者肢體偏癱癥狀，婁淑杰等[10]建立腦缺血模型，證實跑臺運動則可進一步提高海馬的神經再生水平，無論是缺血側還是健側，跑臺運動組動物海馬和齒狀回內免疫陽性細胞數均明顯高于對照組動物。大量實驗已經證實，運動訓練可以促進大鼠神經功能和體重恢復，減少大鼠腦梗死體積，有利于腦缺血大鼠的康復[11-12]。這些實驗結果與筆者的前期研究結果都是一致的，有氧訓練增強大鼠局灶性腦缺血后神經功能修復[13]，在本組實驗中，有氧運動組神經功能缺失評分低于對照組，肢體活動能力康復效果好，說明有氧運動訓練能夠改善腦缺血后偏癱。NO和NOS表達與不同運動強度相關，田振軍等[14]等同樣采用跑臺訓練方式，建立了大鼠有氧運動和疲勞運動模型，不同強度運動大鼠腎臟皮質區NOS的表達均有升高，運動誘導NO的生成增加，但大強度運動可促進大鼠腎臟皮質區的細胞凋亡，且與NO大量生成有關。本實驗中，與對照組比較，有氧運動組和疲勞運動組NO和NOS均有不同程度的升高，但從電鏡觀察細胞超微結構和神經功能缺失的評分均可以發現，有氧運動組缺血神經細胞結構修復和神經功能缺失改善明顯好于疲勞運動組，其機制可能是因為有氧運動能夠促進以保護神經細胞的eNOS來源為主NOS表達升高，促進NO合成增加，擴張局部血管，改善缺血神經細胞營養，促使缺血神經細胞結構和功能修復[15-16]；相反，疲勞運動能組中大強度運動量引起以神經毒性的iNOS來源為主NOS表達明顯升高，促進NO合成大量合成，NO的過度表達出現局部神經細胞凋亡。

綜上所述，不同運動訓練強度均能夠促進腦缺血區域NO和NOS的表達升高，有氧運動以促進發揮神經保護作用的eNOS表達為主，建立側支循環，改善腦梗死局部區域血運，促進神經細胞結構修復和神經功能的恢復，而疲勞運動使iNOS表達明顯升高，引起NO過表達，對局部神經細胞產生神經毒性，出現細胞凋亡現象，這對于應用適宜運動強度治療腦缺血后偏癱有十分重要的意義。

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