細胞外基質復合溫敏性水凝膠與膀胱上皮細胞的生物相容性

楊淑紅 楊嗣星 姚 頤 廖文彪 趙凱亮 李永偉 宋 超武漢大學人民醫院泌尿外科，湖北武漢 430060

支架材料是組織工程學研究的重要內容之一。理想的組織工程支架材料必須具有良好的生物相容性，而且適合種子細胞在支架上黏附、生長[1]。溫度敏感性水凝膠（temperature sensitivity hydrogel，TSH）又被稱為溫固化水凝膠，當溫度超過相變溫度時，黏度急劇增高，由液態變為凝膠態[2]。本研究小組在前期已證實經TSH改良的細胞外基質（extracellular matrix，ECM）所制備的復合支架材料與膀胱平滑肌細胞具有良好的相容性[3]。為給體內研究提供更充足的實驗依據，本研究將進一步探索該支架材料與膀胱移行上皮的生物相容性。

1 材料與方法

1.1 主要材料與設備

新西蘭兔由武漢大學實驗動物中心提供；主要試劑有：PEO-PPO-PEO三嵌段共聚物（購于BASF公司），小鼠抗兔細胞角蛋白單克隆抗體 （AE1/AE3）（購于Santa Cruz公司），FITC標記羊抗小鼠單抗隆抗體 （購于Abcam公司），磷酸緩沖鹽溶液 （phosphate buffered saline，PBS），甲醇、丙酮、戊二醛，DMEM F12培養基，Dispase酶，Ⅱ型膠原酶，胎牛血清（fatal bovine serum，FBS），二甲基亞砜（DMSO）、MTT均購于Sigma公司。相差倒置顯微鏡 （日本OLYMPUS），恒溫培養箱（日本Napco公司），超凈操作工作臺（北京半導體設備一廠），掃描電子顯微鏡（日本SANYO）。

1.2 方法

1.2.1 兔膀胱移行上皮細胞的原代培養及鑒定 選用4周齡新西蘭兔，雌雄不限，體重2.0～2.5 kg，空氣栓塞處死后，無菌條件下取膀胱前壁組織（2 cm×2 cm），小心分離膀胱黏膜與肌層，將黏膜層組織迅速置入含慶大霉素（20 μg/mL）的PBS中浸泡并漂洗3次。將黏膜組織剪碎成1 mm2大小的組織塊，轉入新鮮配制的Dispase酶消化液中，于4℃下消化18 h后再用PBS洗滌1次，用不銹鋼網濾去組織殘塊，收集細胞懸液于混合消化液 （0.02%EDTA+0.25%胰酶）中。37℃振蕩消化10 min，每2分鐘吹打1次，直至成為單細胞懸液，加入FBS終止消化，PBS洗滌3遍，離心8 min（1000 r/min），棄上清，用培養液吹打混勻，再將細胞接種到含10%FBS的DMEM-F12培養基中，置37℃恒溫、5%CO2飽和濕度孵箱內常規培養。

將上述培養的細胞傳2～4代后接種于蓋玻片上再培養2 d，待細胞完全貼壁后，以PBS液沖洗，甲醇、丙酮固定10 min，以小鼠抗兔細胞角蛋白單克隆抗體（AE1/AE3）為一抗，以FITC標記羊抗小鼠單抗隆抗體為二抗，孵育、中性樹膠封片，于490 nm的藍色熒光倒置顯微鏡下觀察。以PBS代替一抗作為空白對照。

1.2.2 ECM/TSH復合支架的構建 參考本小組前期研究[3]的方法制備TSH，使用前紫外線照射30 min備用。參照Yang等[4]報道的方法制備ECM，將成品分成32塊（1 cm×1 cm），經冷凍干燥后，環氧乙烷消毒，干燥保存于4℃。在低溫（4℃）真空環境下，將16塊制備的ECM浸入TSH溶液中1 h，取出后經低溫冷凍干燥機凍干，分裝密封，經環氧乙烷消毒，常溫干燥保存備用。

1.2.3 細胞相容性 實驗分為四組，每組16孔，A組：ECM/TSH復合支架種植膀胱上皮細胞組；B組：單純ECM種植膀胱上皮細胞組；C組：單純培養膀胱上皮細胞組；D組：無細胞培養液組。種植細胞前先用培養液將支架材料預濕，取第3代膀胱上皮細胞懸液 （濃度1×105/mL）50 L緩慢接種于材料上，4 h后再加入DMEM F12培養基（含FBS），置37℃恒溫、5%CO2飽和濕度孵箱內培養，2 d后換液，倒置相差顯微鏡下觀察細胞黏附、生長情況。

1.2.4 膀胱上皮細胞生長情況掃描電鏡觀察 膀胱上皮細胞與支架材料復合培養48 h后，A、B組各取一塊材料/細胞復合物，經過PBS漂洗3次，3%戊二醛、2%的四氧化鋨雙重固定、脫水、醋酸異戊酯置換、干燥、噴金，掃描電鏡觀察。

1.2.5 細胞活力檢測 膀胱上皮細胞接種后，分別于1、3、5和7 d每個時間點各取4孔，分別加入MTT（5 mg/mL），酶反應 4 h，棄上清，加入 150 μL DMSO，震蕩 10 min，在酶聯免疫檢測儀上選擇490 nm波長讀取吸光度（OD）值（A），計算細胞相對增值率（relative growth rate，RGR）：RGR=[實驗組（A組）A值-空白組（D組）A值]/[陰性對照組（C組）A值-空白組（D 組）A 值]×100%。

1.2.6 細胞計數 每5、10天從A、B兩組中各取一塊支架材料，用PBS清洗，去除未附著的細胞，再用0.25%胰酶消化，血球計數板進行細胞計數，觀察細胞黏附數量及增殖情況。

1.3 統計學方法

采用統計軟件SPSS 13.0對實驗數據進行分析，計量資料數據以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 原代培養細胞形態

圖1 空白對照組熒光顯微鏡觀察（×200）

細胞接種時呈圓形，大小均一，輪廓清晰，胞漿透亮。接種24 h后，可見細胞貼壁生長，細胞密集生長區域可見細胞伸展后相互連接呈簇狀，呈散在的簇片狀分布，細胞間連接緊密，形態呈典型的“鋪路石樣”表現，符合上皮細胞特征。3 d后細胞進入對數生長期，7 d可連接成片，長滿整個培養瓶底部。

免疫熒光檢測，各代培養細胞角蛋白免疫熒光均為陽性，在藍色熒光的照射下激發出綠色熒光，陽性率約99%。而空白對照組未激發出綠色熒光（圖1），培養（12 h）的膀胱黏膜上皮細胞發出綠色熒光，細胞排列呈典型的“鋪路石樣”表現。

2.2 組織學檢查

2.2.1 種植細胞前后的復合支架材料 倒置相差顯微鏡下觀察：ECM為網狀結構，HE染色后可見紅染的膠原纖維規則排布，纖維較細，網孔較大，未見到細胞碎片；復合TSH后膠原直徑變粗，網孔孔徑變小。種植膀胱上皮細胞后4 h，光鏡下可見細胞緊密黏附于材料表面，少數散落到培養瓶底貼壁生長。加入培養基10 h，可見細胞已伸展，有多個突起。培養3 d時，黏附于材料的細胞數量增加，細胞增殖明顯。

2.2.2 掃描電鏡觀察 種植細胞前復合支架材料于掃描電鏡下觀察可見基質材料由許多連接成網狀的纖維組成，纖維間呈現1～8 μm的微孔，凝膠分子覆蓋其上，沒有發現細胞碎片。種植后可見發育良好的細胞和細胞群黏附于材料上，偽足沿纖維伸展，附著較牢固，細胞間連接緊密，有的可見到ECM的分泌（圖2），可見ECM復合TSH后，膠原直徑變粗，交織成網。發育良好的細胞黏附于材料上，開始沿纖維伸展偽足，表面可見到ECM的分泌。

2.2.3 細胞活力測定膀胱上皮細胞在單純ECM上黏附性良好，黏附率為 83.5%（24 h ODB組/ODC組），復合了TSH 后的ECM表面黏附能力較之增強，黏附率為92.3%（24 h ODA組/ODC組）。從表1中數據可以得出A、C兩組的細胞數量高于B組（P=0.004），而且，A、C兩組間細胞黏附數量的差異亦有統計學意義（P=0.027），三組的細胞倍增時間均為3 d。7 d時，A組細胞數量明顯高于B、C組，組間差異有高度統計學意義（P=0.006），B、C 組間 P=0.041。

表1 不同時間各組OD值的比較（±s，n=4）

表1 不同時間各組OD值的比較（±s，n=4）

ABC 0.408±0.019 0.368±0.022 0.443±0.029 0.447±0.022 0.384±0.033 0.491±0.022 0.514±0.020 0.428±0.024 0.588±0.029 0.701±0.039 0.574±0.032 0.711±0.025組別 d1 d3 d5 d7

3 討論

組織工程學是綜合應用工程學和細胞生物學的原理，將體外培養擴增后的種子細胞與可降解的生物支架材料相復合，再將其回植體內缺損部位，從而再生成具有正常結構和功能的組織，達到真正意義上的生物學修復[5-6]。材料的生物相容性檢測是該領域不可缺少的重要組成部分，理想的組織工程支架材料應當具有良好的細胞相容性、能夠促進細胞增殖和組織形態的形成，為此本小組做了系列研究[7-8]。

與筆者前期研究結果相似，本實驗中ECM/TSH復合材料比單純ECM，纖維直徑變粗，網孔孔徑變小，與接種細胞的接觸面積增大。經TSH修飾以后的ECM對細胞表現出更強的黏附性，為細胞的附著、生長、增殖提供了良好的微環境。超微結構觀察顯示，植入的膀胱上皮細胞能夠緊密地附著于ECM膠原纖維之上，細胞之間形成緊密聯結，周圍可觀察到ECM的分泌。MTT檢測結果表明膀胱上皮細胞易于在ECM/TSH復合支架材料上生長，增殖情況較好，符合膀胱黏膜上皮細胞的生長規律，細胞未見凋亡和分化，實驗結果提示ECM/TSH復合支架材料與膀胱黏膜上皮細胞具有良好的生物相容性，為下一步應用于體內研究提供了實驗依據。

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