超高效液相-質譜聯用鑒定云南雪膽和云南地不容的研究

楊 艷 陳旭冰 陳光勇 劉光明

1.云南省大理州人民醫院，云南大理 671000；2.大理學院藥學院，云南大理 671000

云南雪膽（Hemsleya sinesis Cogn of Yunnan）為葫蘆科（Cucurbitane）雪膽屬（Hermleya）植物的干燥塊根，具有清熱、解毒、消腫止痛的功效，民間用來治療肝炎、氣管炎、胰腺炎、慢性子宮頸炎、帶狀皰疹、腫瘤等[1-5]。云南地不容（Stephania yunnanensis H.S.Lo）為防己科（Menisermaceae）千金藤屬（Stephania）植物的干燥塊根，具有清熱、解毒、鎮靜、止痛、理氣等功能，民間用于治療風濕骨痛、胃痛、毒蛇咬傷等[6-7]。云南雪膽和云南地不容均為云南著名的傳統中草藥，民間使用較為廣泛，二者均為干燥塊根，從外形上看極其類似，很容易混淆，給人們的使用帶來諸多不變。因此，建立一種快速檢測方法，以區分兩種藥材是非常必要的。

超高效液相-質譜聯用（UPLC-MS）作為一種新的檢測技術，廣泛用于各種分析檢測領域，它可以同時獲得液相色譜和質譜圖，根據離子流信息計算出化合物的分子量，分析各種離子碎片可以確定化合物的結構式，從而在樣品不純時便能知道其主要成分，這對于天然產物的研究極為重要。本研究采用UPLC-MS對云南雪膽和云南地不容進行檢測，從而建立一種鑒別兩種藥材的快速檢測方法，為研究和使用兩種藥材提供一定依據。

1 材料與儀器

云南雪膽和云南地不容藥材購自云南省藥材公司（分別產自云南西雙版納和云南文山），經大理學院藥學院周濃副教授鑒定為葫蘆科雪膽屬植物雪膽Hemsleya sinesis Cogn of Yunnan 和防己科千金藤屬植物云南地不容Stephania yunnan ensis H.S.Lo的干燥塊根；標準品左旋四氫巴馬汀Tetrahydropalmatine 和雪膽甲素CucurbitacinⅡa購于中國科學院上海藥物研究所國家重點實驗室；實驗試劑均為色譜純，實驗用水為純凈水。電子分析天平（Startorius CPA225D）；液相色譜/單極四級桿質譜儀（Waters，ACQUITY SQD LC/MS System）；C18反 相 柱（Waters，ACQUITY UPLC BEH C18，1.7 μm，2.1 mm×100 mm）。

2 方法與結果

2.1 供試品的制備

分別將云南雪膽和云南地不容塊狀根粉碎，各取5 g 置于250 mL 茄形瓶中，加入95%乙醇各125 mL，于80℃下水浴加熱2 h，濾去殘渣，分別將提取液減壓蒸干至無醇味。分別將提取物用甲醇溶解置于10 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。溶液經0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得供試品。

2.2 UPLC 條件

檢測樣品采用超高效液相色譜儀（Waters，ACQUITY UPLC H-class core system），配有超高效液相紫外檢測器（Waters，ACQUITY UPLC TUV Detector）， 色譜柱采用 C18反相柱（Waters，ACQUITY UPLC BEH C18，1.7 μm，2.1 mm×100 mm），柱溫 45℃。乙腈為色譜純（Merck，gradient grade for liquid chromatography），水為純凈水。展開劑采用乙腈-水，從10%（V/V）到100%乙腈梯度洗脫，時間為6 min[8]。

2.3 UPLC-MS 檢測

采用液質聯用儀（ACQUITY SQD LC/MS System）進行檢測，單四極桿質譜檢測器，ESCI 離子源，電噴霧所用氣體為氮氣。

2.4 檢測結果

云南雪膽和云南地不容經UPLC-MS 檢測，結果見圖1、2。圖1A 中，所含主要成分保留時間為2.56 min，在負離子譜（圖 2A）中觀察到負離子峰如下：561.5（[M-H]-），607.5（[M+COOH]-），1169.8（[2M+COOH]-）。在正離子譜（圖 2B）中觀察到正離子峰如下：503.4（[M-AcO]+），1147.6（[2M+Na]+）。很容易確定其分子量為562.5，與文獻報道雪膽中所含主要成分雪膽甲素的分子量一致，所以確定該藥材為雪膽。圖1B 中，所含主要成分保留時間為1.83 min，在正離子譜（圖 2C）中觀察到離子峰如下：356.3（[M+H]+），357.3（[M+2H]2+），確定其分子量為355.3，與文獻報道云南地不容所含主要成分左旋四氫巴馬汀的分子量一致，確定該藥材為云南地不容（云南地不容沒有負離子譜）。將供試品的保留時間、質譜圖與標準品的保留時間、質譜圖進行對照，保留時間一致，質譜圖一致，證明該方法準確無誤。

圖1 云南雪膽和云南地不容UPLC

3 討論

超高效液相色譜（ultra performance liquid chromatography，UPLC）系指一種采用小顆粒填料色譜柱（粒徑小于2 μm）和超高壓系統（壓力大于105 kPa）的新型液相色譜技術，能顯著改善色譜峰的分離度和檢測靈敏度，同時大大縮短分析周期，因此特別適用于微量復雜混合物的分離和高通量研究。2004年3月，Waters公司率先推出了第一臺商品化的超高效液相色譜系統（acquity，UPLC TM）。自問世以來，超高效液相色譜發展很快，現已成功應用于農藥殘留物檢測、水質和環境監測、化妝品質量控制、藥物及制劑的分析檢測和質量控制、中藥復雜組分分析及代謝組學等領域[9-10]。云南雪膽所含主要成分雪膽甲素的保留時間為2.56 min，通過負離子和正離子譜，可確認云南雪膽的分子量為562.5。云南地不容主要成分左旋四氫巴馬汀的保留時間為1.83 min，通過正離子譜，可確認其分子量為355.3，與相關文獻報道基本一致，從而可快速對上述兩種外形較為相似的中藥材進行快速鑒別。本實驗采用UPLC-MS 檢測云南雪膽和云南地不容，對其主要成分的質譜圖進行分析，并對主要離子峰進行歸屬，確定分子量，從而鑒別兩種藥材。天然產物的品種繁多，許多藥材外形極其類似，容易混淆，采用UPLC-MS 檢測，可以在不分離純化的前提下，快速確定其主要成分，從而鑒定藥材，方法可靠，結果準確。

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