阿托伐他汀抑制老年大鼠心肌白細胞介素-1β表達機制研究

韓 磊，葉 平，李鳴皋

隨著社會逐漸向老齡化發(fā)展，衰老的機制及防護也成為廣大學者研究的熱點。研究表明［1-4］，他汀類藥物作為臨床應用最廣泛的調(diào)脂藥物，還有許多調(diào)脂之外的作用，如抗炎、保護內(nèi)皮細胞、逆轉(zhuǎn)左室重構(gòu)、抑制動脈粥樣硬化等。本研究以培養(yǎng)老年大鼠心肌細胞為研究對象，觀察阿托伐他汀抑制老年大鼠心肌細胞炎性因子白細胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)表達的作用與過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator activated receptor γ，PPARγ)信號轉(zhuǎn)導途徑的關(guān)系，為研究心臟衰老的病理生理機制及其防治措施進行初步探索。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 Wister大鼠(北京維通利華公司)，阿托伐他汀(大連輝瑞制藥公司，批號:75837005)，Ⅰ型膠原酶(Sigma公司)，胰蛋白酶(Sigma公司)，DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)，二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)溶液(Sigma公司)，小牛血清(Gibco公司)，GW9662(Sigma公司)，RTPCR試劑盒(Takara公司)，羊抗鼠 IL-1β一抗(美國Santa cruz公司)，羊抗鼠GAPDH一抗(美國San-ta cruz公司)，HRP兔抗羊二抗(美國Santa cruz公司)，超敏發(fā)光液(北京普利來公司)，CO2細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司HEPA class 100型)，超凈工作臺(北京半導體設備一廠)，倒置顯微鏡(Olympus)，PCR儀(美國Bio-Rad公司2720型)，垂直電泳儀(美國Bio-Rad公司Power PacTMBasic)，核酸分析儀(美國Beckman公司DU-640型)，臺式冷凍高速離心機(美國Beckman公司)，全自動凝膠分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司Gel Doc 2000型)。

1.2 老年大鼠原代心肌細胞的分離培養(yǎng) 30只10月齡的Wister大鼠，雌雄各半，飼養(yǎng)至24月齡時作為實驗對象，體重(637.3±60.1)g。以2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉大鼠，常規(guī)消毒后，剪開大鼠胸腔，迅速取出心臟并分離左室心肌。將心肌組織剪成1 mm3大小的組織塊后，以0.1%胰蛋白酶和0.1%的Ⅰ型膠原酶消化心肌組織。消化下來的細胞懸液以80目篩網(wǎng)過濾，在室溫下離心后，收集細胞以DMEM培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細胞濃度至2×105/ml。將細胞接種于培養(yǎng)瓶中，以差速貼壁法去除非心肌細胞后，將心肌細胞移至新培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 實驗分組及處理 分別以DMSO溶解阿托伐他汀和GW9662。將培養(yǎng)的老年大鼠心肌細胞編號后隨機分為4組，每組10只。即阿托伐他汀組、阿托伐他汀+GW9662組、溶劑對照組、空白對照組。各組分別給予以下處理:①阿托伐他汀組:加入配制好的阿托伐他汀溶液，使培養(yǎng)液中阿托伐他汀的濃度為10 μmol/L，置于培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)12 h;②阿托伐他汀+GW9662組:加入PPARγ拮抗劑GW9662溶液，使其在培養(yǎng)液中的濃度為5 μmol/L，培養(yǎng)0.5 h后，再加入阿托伐他汀溶液，使其在培養(yǎng)液中的濃度為10 μmol/L，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h;③溶劑對照組:細胞培養(yǎng)液中加入等體積的DMSO溶液，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h;④空白對照組:加入等體積DMEM細胞培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。

1.4 RT-PCR方法檢測各組心肌細胞IL-1β mRNA表達水平

1.4.1 引物合成:由賽百盛生物技術(shù)公司合成，序列見表1。

表1 合成引物序列及擴增產(chǎn)物分子量

1.4.2 RT-PCR反應:以TRIzol一步法提取各組老年大鼠心肌細胞的總RNA。嚴格按RT-PCR試劑盒的程序操作:①將各樣本的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應條件為:42℃、30 min→99℃、5 min→5℃、5 min;②分別用相應的引物擴增IL-1β及GAPDH。其中，IL-1β 的PCR 反應條件為:95℃、5 min，94℃、45 s→50℃、1 min →72℃、1 min(33個循環(huán))，72℃、8 min;③PCR產(chǎn)物以2%瓊脂糖凝膠進行電泳后，在圖像分析儀下掃描，以IL-1β與GAPDH的光密度之比作為IL-1β mRNA的相對表達量。

1.5 Western bolt方法測定各組IL-1β蛋白含量按照以下步驟進行:①樣本細胞用4℃的PBS洗滌3次;②加入單去污裂解液，冰上裂解30 min;③取裂解液，4℃下12 000 g離心5 min;④吸取上清液，加入loading buffer后煮5 min，置于－80℃冰箱備用;⑤另取少量上清液，用核酸分析儀測定其蛋白濃度，計算各樣品的上樣量;⑥各樣本根據(jù)上樣量進行上樣，60 V電壓下進行垂直電泳和轉(zhuǎn)膜;⑦5%脫脂奶粉封閉1 h，膜入羊抗鼠一抗中，4℃過夜;⑧洗膜后加入兔抗羊二抗，室溫下孵育2 h;⑨洗膜后加入發(fā)光液，于暗室中進行曝光反應。用圖像分析軟件進行分析，將IL-1β條帶與GAPDH灰度值與面積的乘積之比，作為其IL-1β蛋白的相對含量。

1.6 統(tǒng)計學處理 所有數(shù)據(jù)均用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包處理，計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示，采用單因素方差分析，α=0.05為檢驗水準。

2 結(jié)果

2.1 心肌細胞的培養(yǎng) 老年大鼠心肌細胞培養(yǎng)成功，在顯微鏡下，心肌細胞多表現(xiàn)為桿狀或者矩形，表面有清晰的橫紋，少量的心肌細胞呈現(xiàn)為類圓形，見圖1。

圖1 老年大鼠心肌細胞(×400)

2.2 心肌細胞IL-1β mRNA及IL-1β蛋白含量的比較 各組IL-1β mRNA表達水平、IL-1β蛋白含量見圖2、3及表2。與空白對照組相比，溶劑對照組大鼠心肌細胞的IL-1β mRNA表達水平及IL-1β蛋白含量均無顯著差異(P＞0.05);阿托伐他汀組IL-1β mRNA表達水平及IL-1β蛋白含量均低于空白對照組、溶劑對照組(P＜0.01);阿托伐他汀 +GW9662組的IL-1β mRNA表達水平及IL-1β蛋白含量均高于阿托伐他汀組(P＜0.05)，但仍顯著低于空白對照組、溶劑對照組(P＜0.05或P＜0.01)。

圖2 老年大鼠心肌細胞IL-1β mRNA RT-PCR結(jié)果

圖3 老年大鼠心肌細胞IL-1β蛋白含量電泳結(jié)果

表2 各組大鼠心肌細胞IL-1β mRNA及IL-1β蛋白含量的比較(±s)

表2 各組大鼠心肌細胞IL-1β mRNA及IL-1β蛋白含量的比較(±s)

注:IL-1β mRNA表達水平為IL-1β與GAPDH光密度之比，IL-1β蛋白含量為IL-1β與GAPDH灰度值之比。與空白對照組比較，aP＜0.05，bP＜0.01;與溶劑對照組比較，cP ＜0.05，dP ＜0.01;與阿托伐他汀組比較，eP＜0.05

組別 鼠數(shù)IL-1β mRNA表達水平IL-1β蛋白含量阿托伐他汀組 10 0.439 ±0.096bd0.233 ±0.062bd 10 0.726 ±0.132 0.604 ±0.123阿托伐他汀+GW9662組 10 0.568 ±0.104ace0.348 ±0.114bde空白對照組 10 0.698 ±0.119 0.570 ±0.121溶劑對照組

3 討論

近年來，心肌細胞的體外培養(yǎng)技術(shù)正日漸成為研究心臟結(jié)構(gòu)、功能與心血管疾病發(fā)生發(fā)展機制的重要手段［5-7］。受技術(shù)水平的限制，國內(nèi)多數(shù)情況下是用乳鼠的心肌細胞進行培養(yǎng)，鮮見以衰老心肌細胞進行體外培養(yǎng)來開展研究的報道。然而，乳鼠的心肌細胞在代謝和功能方面畢竟不同于衰老心肌細胞，為準確反應衰老心肌的特點及對干預因素的反應，特進行了研究。

本研究中，阿托伐他汀組心肌細胞的IL-1β表達水平顯著低于空白對照組，提示阿托伐他汀有著顯著的抗炎作用，這同以往的研究是一致的。本研究發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀在自然衰老的生理條件下，也具有抗炎等保護作用。既往研究表明，炎癥因素在心臟衰老的病理生理過程中起著重要的作用，心肌細胞產(chǎn)生炎癥因子后，可直接導致心臟的衰老性改變［8-10］。如炎癥因子可與活性氧協(xié)同促進和誘導心血管系統(tǒng)的衰老［11］;炎癥因子在體內(nèi)的含量隨年齡增加而增多，其可通過多條通路介導機體的氧化應激狀態(tài)，進而導致心血管系統(tǒng)的老化［12］。因此，在自然衰老狀態(tài)下，阿托伐他汀抑制炎癥因子表達，提示其可能具有抑制心肌老化改變的作用。

已有的研究證實，阿托伐他汀干預可抑制IL-1β 等炎性因子的表達［13-14］，還可顯著上調(diào) PPARγ的表達水平［15］。為明確究竟是阿托伐他汀使得PPARγ信號通路激活，進而抑制了IL-1β等炎性因子的表達，還是阿托伐他汀先抑制了炎性因子IL-1β的表達，進而激活了PPARγ信號轉(zhuǎn)導途徑，本研究采用PPARγ拮抗劑GW9662來阻斷PPARγ信號轉(zhuǎn)導途徑，然后觀察阿托伐他汀抑制IL-1β表達的作用有無受到影響。結(jié)果顯示，給予GW9662阻斷PPARγ信號轉(zhuǎn)導途徑后，衰老心肌中IL-1β的表達顯著增強。這一結(jié)果提示，通過阻斷PPARγ信號轉(zhuǎn)導途徑，可部分抑制阿托伐他汀的抗炎作用。這也進一步提示阿托伐他汀使得PPARγ信號通路激活，進而抑制了IL-1β等炎性因子的表達。但在現(xiàn)階段，阿托伐他汀是如何通過PPARγ信號通路來進抑制炎性因子IL-1β表達機制尚不清楚。

我們在研究中還發(fā)現(xiàn)，阿托伐他汀+GW9662組的IL-1β的表達水平雖高于阿托伐他汀組，但仍明顯低于空白對照組。這一結(jié)果提示，雖然通過GW9662阻斷了PPARγ信號轉(zhuǎn)導途徑，阿托伐他汀抑制IL-1β表達的作用仍未被完全阻斷。這也進一步提示，激活PPARγ信號通路僅是阿托伐他汀抗炎作用的重要途徑之一，但并不是唯一的途徑。究竟在PPARγ信號通路以外，還存在哪些信號通路來介導阿托伐他汀抑制衰老心肌細胞中炎性因子表達的作用，目前尚不十分清楚，需要進一步加以研究。

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