應用小鼠早期胚胎活性因子誘導小鼠成纖維細胞再程序化為多能干細胞的實驗研究

劉 婷，王立斌，朱永朝，金毅然，李玉奎，魏 軍 (寧夏醫科大學總醫院寧夏人類干細胞研究所，寧夏 銀川 750004)

體細胞再程序化的研究主要包括核移植技術、細胞融合技術、利用卵細胞和干細胞的活性因子誘導體細胞的再程序化、基因轉導技術這四種技術［1］，但是現行幾類再程序化技術均存在誘導效率低、遺傳變異高或者依賴病毒轉染，無法大批量應用。鑒于此，本研究希望能夠建立一種新的應用小鼠早期胚胎活性因子的再程序化技術生成多能干細胞。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料:6～8周齡ICR小鼠，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.2 主要儀器及試劑:倒置顯微鏡、解剖顯微鏡(Olympus公司)，二氧化碳培養箱(Thermo公司)，PCR儀(Eppendorf公司)，胎牛血清、DMEM、胰蛋白酶、Trizol(Invitrogen公司)，M2培養液、M16培養液(Sigma)，反轉錄試劑盒(Fermentas公司)，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.3 實驗方法

1.3.1 小鼠成纖維細胞的獲得與培養:取孕13 d的母鼠，在無菌條件下取出胎鼠，分離背部皮膚，將組織充分剪碎，加入0.125%的胰蛋白酶在4℃消化1 h后，用等量的含FBS的DMEM終止消化，吸取上清液離心。去上清，加培養液，吹打懸浮后以5×105/ml密度接種于培養瓶，在37℃、5%CO2的培養箱中培養。

1.3.2 小鼠體外受精:體外受精及早期胚胎的培養均采用微滴培養法，將受精卵培養至3.5 d囊胚，大量收集凍于-80℃冰箱。

1.3.3 小鼠早期胚胎蛋白的獲得:將收集得到的小鼠3.5 d囊胚轉移至含有蛋白酶抑制劑的裂解液中超聲，12 000 rpm，4℃，離心15 min，取上清，測定蛋白濃度，凍于-80℃冰箱備用。

1.3.4 應用小鼠早期胚胎蛋白誘導小鼠成纖維細胞再程序化:將培養的小鼠成纖維細胞消化后，調整細胞濃度為2×105個/ml，做10～15個20 μl微滴，將之前制備的小鼠3.5 d囊胚蛋白10 μl加入到微滴內，隔天等量補充，待細胞增殖至90%密度后，常規傳代培養擴增。

1.3.5 誘導后多能干細胞形態學觀察:取誘導前后，不同階段的細胞于倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況及形態變化，采用MTT法測定P3代細胞生長曲線。

1.3.6 誘導后多能干細胞特異性基因表達鑒定:采用Trizol法抽提再程序化后小鼠多能干細胞總RNA，反轉錄，PCR測定多能干細胞特異性基因Oct 3/4(引物序列)，詳見表1。

表1 引物序列

1.3.7 誘導后多能干細胞多向分化潛能鑒定:按本實驗室已經建立的誘導分化體系［5］，將獲得的小鼠多能干細胞誘導向脂肪細胞、成骨細胞分化，并鑒定。

2 結果

2.1 小鼠成纖維細胞與3.5 d囊胚的形態學特征:原代培養的小鼠成纖維細胞大約4～6 h貼壁，雜細胞較多，傳代至第三代，細胞形態均一，為梭形或多邊形，生長速度較快(見圖1)。體外受精獲得的胚胎各階段發育良好(見圖2)。

圖2 體外受精不同階段小鼠受精卵形態

2.2 再程序化后的小鼠多能干細胞的形態學觀察與生長特性鑒定:加入小鼠3.5 d囊胚蛋白后，可以觀察到小鼠成纖維細胞的胞質開始部分回縮成圓形，細胞核增大，細胞增殖加快(見圖3)。MTT法測定第三代細胞的生長曲線，細胞傳代后潛伏期約為24 h，然后細胞增殖速度加快，進入對數增殖期，72 h后生長速度減緩(見圖4)。

圖3 誘導再程序化后的小鼠多能干細胞形態

圖4 MTT法測定P3代細胞生長曲線

2.3 再程序化后的小鼠多能干細胞的基因表達鑒定:電泳結果顯示，再程序化后的多能干細胞表達干細胞特異性基因Oct3/4，并且這種特性不受細胞代次影響(見圖5)。

圖5 Oct 3/4基因表達鑒定

2.4 再程序化后的小鼠多能干細胞的多向分化潛能鑒定:在脂肪細胞定向分化條件下，細胞停止增殖，胞質增大，出現大量脂滴被油紅O染色為紅色(見圖6A)。在成骨細胞誘導分化條件下，細胞大片聚集重疊生長，茜素紅染色可見紅色鈣結節(見圖6B)。

圖6 再程序化后的小鼠多能干細胞向脂肪細胞、成骨細胞的誘導鑒定

3 討論

目前體細胞再程序化技術均存在各種局限。核移植技術雖然已成功應用于多種動物的克隆和人的早期胚胎的培育，但是成功率低并能誘發較高的遺傳變異。細胞融合技術雖然已成功應用于細胞再程序化機制的研究，但其生成正常細胞的效率過低而不能應用于臨床干細胞的培育。基因轉導技術已經先后成功培育出小鼠和人的多能干細胞［2-3］。并且，由此技術生成的多能干細胞已經成功用于地中海貧血癥的模型動物的治療。基因轉導技術是目前體細胞再程序化研究領域最成功的技術。然而，由于這一技術依賴于利用病毒的基因轉導，由此技術生成的多能干細胞因帶有病毒這一潛在的不安全因素而不能應用于臨床。最后是利用卵細胞和干細胞的活性因子誘導體細胞的再程序化，已經證明非洲爪蟾卵細胞和小鼠胚胎干細胞的蛋白內容物能夠使體細胞轉化成多能干細胞，但是這一技術尚未能培育出穩定的再程序化干細胞。

為了解決現有再程序化技術應用的局限，本研究提取小鼠早期胚胎總蛋白用于誘導成纖維細胞再程序化，初步確定得到的細胞能夠長期增殖不分化，表達干細胞特異性基因Oct3/4，可以誘導分化為脂肪細胞和成骨細胞。證明在早期胚胎中含有可使體細胞轉化成多能干細胞的再程序化因子，可以不使用基因轉導的方法生成穩定的多能干細胞。本研究如果能夠進一步在人體細胞中得到證實，將有望獲得無病毒轉導，可用于臨床的患者個體化和疾病特異性的多能干細胞。

［1］ Takahashi K，and Yamanaka S.Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors［J］.Cell，2006，126(4):663.

［2］ Libin Wang，Yinxue Yang，Yongzhao Zhu，et al.Characterization of placenta-derived mesenchymal stem cells cultured in autologous human cord blood serum［J］.Molecular Medicine Reports，2012，6(4):760.

［3］ Takahashi K，Tanabe K，Ohnuki M，et al.Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors［J］.Cell，2007，131(5):861.