具抗凝血作用的三種釹配合物與人血清白蛋白的相互作用

宋玉民 王 莉 姚小強

(西北師范大學化工學院，蘭州 730070)

隨著我國社會經濟的發展和控制人口過快增長政策的多年實施，目前我國社會開始進入老齡化階段，而腦血栓是老年人的一種常見疾病。故對具有抗凝血藥物的研究早已是藥物學家研究的重點。具抗凝血作用的金屬配合物的合成和性質研究亦成為化學家關注的研究課題。前期本課題組研究了一些稀土華法靈配合物、稀土水楊酸配合物、稀土華法靈、水楊酸三元配合物和稀土半胱氨酸、枸櫞酸鈉三元配合物、稀土納米氧化物肝素雜化材料的抗凝血功效[1-3]。研究表明,配合物的抗凝血效果均比配體好；二元配合物的抗凝血效果比三元配合物的抗凝血效果好；釹配合物在同類配合物中的抗凝血作用時間最長。人血清白蛋白是血漿中含量較高的一種蛋白質，也是形成血栓的成分之一。配合物的抗凝血作用是否通過改變HSA的構象來實現，而不同構象的HSA在血液中的溶解、沉降性能是否不同，導致了血栓形成的容易與否，為此本課題組曾對華發靈過渡金屬配合物、水楊酸過渡金屬配合物、華發靈水楊酸過渡金屬三元配合物與HSA之間的作用進行過研究，配合物的存在明顯改變人血清白蛋白的構象[4-6]。為進一步探討配合物改變人血清白蛋白構象的原因，本課題組對形成配合物的中心原子(稀土離子)和配體華法林離子(華法林鈉)及水楊酸分子與HSA分子之間的作用進行了研究[7-9]，結果表明稀土離子的存在對HSA的二級結構幾乎沒有影響，華法林離子(華法林鈉)和水楊酸分子的存在可引起HSA二級結構的變化，華法林離子(華法林鈉)與HSA之間的主要作用力是氫鍵和范德華力，水楊酸與HSA之間的主要作用力是疏水作用力。為進一步了解釹配合物在同類配合物中的抗凝血作用最好的原因，本文報道了對華法靈釹(NdL3·2H2O，L=華法靈離子)、水楊酸釹(NdL′3·2H2O，L′=水楊酸離子)、華法靈水楊酸釹(NdL2L′·2H2O)三種配合物(結構如圖1所示)與HSA相互作用的研究。結果表明：3種配合物均對HSA的熒光產生猝滅作用，華法靈釹和華法靈水楊酸釹配合物對于HSA的猝滅效應屬于兩者之間生成了不發熒光的復合物而導致靜態猝滅，而水楊酸釹是動態猝滅與靜態猝滅兩種效應導致的猝滅。并確定了它們的結合力類型：華法靈釹與HSA之間主要作用力是靜電作用力；水楊酸釹與HSA之間主要作用力為典型的疏水作用力；華法靈水楊酸釹與HSA之間為氫鍵和范德華力。計算了配合物與HSA的結合常數K和結合位點數n。并且發現配合物的存在可引起HSA的構象發生變化，并對HSA在不同濃度的配合物存在時構象發生變化的原因進行了討論。提供了對合成抗凝血效果好、毒性低、水溶性好的藥物有參考意義的實驗基礎。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

LS-55熒光分光光度計(美國PE公司)；Agilent-8453紫外分光光度計 (美國Agilent公司)；J-810圓二色譜儀(日本Jasco公司)；TB-85型恒溫器(日本島津公司)；pHS-25型酸度計(上海第二分析儀器廠)。

人血清白蛋白為國藥集團化學試劑有限公司產品；華法靈釹、水楊酸釹、華法靈水楊酸釹配合物(自制)[1-2]；實驗用水為去離子三次蒸餾水；配制10 mmol·L-1Tris-HCl緩沖溶液，pH=7.37(內含 50 mmol·L-1NaCl的溶液維持離子強度)；其余試劑均為分析純。

1.2 實驗方法

1．2．1 配合物與HSA作用的熒光光譜

實驗所需的HSA溶液用Tris-HCl緩沖溶液配制(CHSA=10 μmol·L-1)，華法靈釹、水楊酸釹與華法靈水楊酸釹配合物用2次蒸餾水溶解(CQ=10μmol·L-1)，移取 2 mL 10 μmol·L-1的 HSA 溶液于 1 cm 石英比色池中，用微量進樣器分別加入不同體積的配合物，分別在20℃和30℃下反應5 min后，以λex=282 nm為激發波長，記錄300～500 nm波長范圍的熒光光譜。并且測定Δλ=15 nm和Δλ=60 nm時的同步熒光光譜。

1．2．2 配合物與HSA作用的紫外吸收光譜

向加有 2．5 mL 的 50 μmol·L-1HSA 溶液的 1 cm石英吸收池中滴加不同體積的相應配合物 (CQ=10 μmol·L-1)溶液，以 Tris-HCl緩沖溶液為參比，掃描紫外吸收光譜。

1．2．3 配合物與HSA作用的圓二色譜(CD)

室溫下，在一系列10 mL比色管中，加入2．5 mL 的 HSA(CHSA=0．10 μmol·L-1)溶液，然后依次加入不同體積的3種配合物溶液，定容后充分震蕩搖勻測定3種配合物與HSA作用的圓二色譜；以相應的Tris-HCl緩沖溶液為參比溶液，樣品池為1 cm石英吸收池。

2 結果與討論

2.1 熒光光譜

圖2 A、B、C分別為華法靈釹配合物、水楊酸釹配合物和華法靈水楊酸釹配合物對HSA溶液熒光影響光譜圖。以激發波長λex=282 nm分別激發HSA溶液和配合物溶液，HSA在λem=348 nm附近有很強的熒光發射峰，而華法靈釹、水楊酸釹與華法靈水楊酸釹3種配合物在該波長附近沒有熒光發射峰。

固定HSA的濃度，依次加入相應的配合物溶液，隨著配合物濃度的增加，HSA在λem=348 nm附近的熒光發射峰強度有規律地減弱，并且可以看到圖2A中發射峰位置有略微的紅移(從348 nm移至354 nm)，HSA在348 nm附近的發射峰是色氨酸殘基所產生的，而色氨酸殘基的最大發射波長與它所處的環境有關，發射波長紅移表明HSA中的色氨酸殘基周圍的疏水性有所降低[10-11]。圖2B中的發射峰位置有略微藍移(從348 nm移至343 nm)，說明水楊酸釹與人血清蛋白之間通過一定的作用形成了復合物[10],發射波長藍移這表明HSA的構象發生了變化，說明色氨酸殘基周圍的疏水性有所增加[10-11]。華法靈水楊酸釹配合物僅使HAS溶液的熒光強度有所降低。

2.2 熒光猝滅方式

熒光猝滅過程通常分為動態猝滅和靜態猝滅兩類[12-13]。動態猝滅主要是依賴于分子的擴散，溫度越高，擴散系數越大，猝滅常數的改變與溫度成正比。而靜態猝滅，溫度升高，基態配合物的穩定性越差，形成常數越小[14]。動態猝滅是猝滅劑和熒光物質的激發態分子之間的相互作用過程。其作用過程遵循Stern-Volmer方程：

其中F0為未加入猝滅劑時的熒光強度；F為加入猝滅劑后的熒光強度；Kq(L·mol-1·s-1)為雙分子猝滅過程的速率常數；Kqτ0=Ksv(L·mol-1) 稱為 Stern-Volmer猝滅常數，CQ為猝滅劑的濃度；τ0為沒有猝滅劑存在時熒光分子的平均壽命，生物大分子的平均壽命約為10-8s[15]；靜態猝滅是猝滅劑和熒光物質分子相互作用生成不發光的基態化合物，從而導致熒光物質熒光強度降低的過程。其熒光強度與猝滅劑濃度之間的關系與公式(1)是相同的，但其常數的物理意義是基態的形成常數[16]。

根據(1)式，以F0/F-1對所加入的配合物濃度CQ作圖，得到人血清白蛋白熒光的Stern-Volmer猝滅曲線。配合物HSA體系在不同溫度下的Stern-Volmer曲線都近似為直線，說明配合物對HSA的熒光猝滅主要存在一種方式，動態猝滅或靜態猝滅[17]。由(1)式求得猝滅速率常數見表1，各類猝滅劑對生物大分子的最大動態猝滅常數為2.0×1010L·mol-1·s-1[18]，然而反應中雙分子猝滅常數Kq遠大于最大動態猝滅常數，且隨著溫度的升高，Kq值變小，該3種配合物對HSA的熒光猝滅過程不是動態猝滅而是配合物和HSA之間生成了不發熒光的復合物而導致的靜態猝滅[19]。

表1 配合物-HSA在不同溫度的Stern-Volmer常數Table 1 Stern-Volmer quenching constant of K sv at different temperature

2.3 用靜態猝滅法分析配合物與HSA相互的作用

在靜態猝滅過程中，熒光物質與猝滅劑分子間的結合常數可根據熒光強度與猝滅劑濃度的關系求出。設蛋白質大分子有n個相同并且相互獨立的結合位置。則有下式求出[20]：

其中F0為未加入猝滅劑時的熒光強度；F為加入猝滅劑后的熒光強度；K為靜態猝滅常數，CQ為配合物的濃度。

相關數據代入式(2)，得到lg(F0/F-1)與lg CQ的關系圖，由圖求出在不同溫度下的NdL3·2H2O，NdL′3·2H2O 和 NdL2L′·2H2O 與 HSA 的結合常數 K以及結合位點數n(見表2)。從表2中可以看出：NdL3·2H2O，NdL′3·2H2O 和 NdL2L′·2H2O 的結合常數K均較小，較大的值也僅在1.0×102L·mol-1，表明配合物與HSA之間的結合力較弱，配合物與HSA的的結合常數隨溫度的升高而減小，進一步說明了這幾種配合物對HSA熒光猝滅為靜態猝滅過程。然而水楊酸釹(NdL′3·2H2O)的結合常數隨溫度的升高而增大，達到了 8.16×102L·mol-1，表明水楊酸釹配合物對HSA熒光猝滅以靜態為主也含有一定的動態猝滅。

2.4 配合物與HSA之間的作用力類型

有機小分子和蛋白質等生物大分子之間的結合力主要有氫鍵、范德華力、靜電引力、疏水作用力等。由反應前后熱力學參數焓變ΔH和熵變ΔS的相對變化，可以判斷小分子與蛋白質分子鏈之間的主要作用力類型[21]。假設在測定的溫度變化范圍內焓變的變化可以忽略，則焓變ΔH和熵變ΔS以及ΔG可以通過以下的熱力學方程式求得(見表3)：

表3 熱力學參數Table 3 Thermodynamic parameters

Mohammed等[22]根據大量的實驗結果總結出判斷生物大分子與小分子結合力性質的熱力學規律，即：ΔS＞0可能是疏水和靜電作用力：ΔS＜0可能為氫鍵和范德華力；ΔH＞0，ΔS＞0 為典型的疏水作用力；ΔH≈0或較小，ΔS＞0 為靜電作用力；ΔH＜0，ΔS＜0為氫鍵和范德華力。從表3數據中可以看出NdL3·2H2O-HSA 體系中 ΔH＜0，ΔS＞0，說明華法靈釹與HSA之間主要作用力是靜電作用力；NdL′3·2H2O-HSA 體系中 ΔH＞0，ΔS＞0， 表明水楊酸釹與HSA之間主要作用力為典型的疏水作用力；NdL2L′·2H2O-HSA 體系中 ΔH＜0，ΔS＜0， 表明華法靈水楊酸釹與HAS之間為氫鍵和范德華力。3種配合物與HSA之間作用力的不同，與3種配合物的中心釹バ離子的有效核電荷的高低有關。因配位基團中的羧酸根所連接的基團不同，導致羧酸根供電子能力不同，直接影響到了中心離子的有效核電荷的高低。配合物 NdL3·2H2O和 NdL2L′·2H2O與HSA反應的ΔH＜0，為放熱反應，升高溫度不利于反應正向進行，而NdL′3·2H2O與HSA反應的ΔH＞0，為吸熱反應，升高溫度利于反應的正向進行，這與配合物的靜態猝滅常數K值隨溫度的變化曲線相一致。

2.5 同步熒光光譜

固定激發波長和發射波長的間距Δλ，同步掃描激發和發射單色器可以得到同步熒光光譜，因其具有簡化光譜、窄化譜帶和減少光譜重疊等優點，而常被用于研究小分子對蛋白質構象的影響，進而探討蛋白質構象的變化[17]。蛋白質的熒光主要來自于色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸所產生的熒光，它們的熒光強度之比一般為 100∶9∶0．5。 由于苯丙氨酸的熒光強度太弱，所以一般重點考察構象發生變化的是色氨酸還是酪氨酸。在Δλ=15 nm與Δλ=60 nm時，HSA的同步熒光分別顯示酪氨酸殘基和色氨酸殘基的特征信息[23]。

圖3為NdL′3·2H2O與HSA相互作用的同步熒光光譜。室溫20℃下，固定HSA的濃度，逐漸增加配合物的濃度，記錄Δλ=15 nm與Δλ=60 nm時的同步熒光光譜。發現酪氨酸殘基的最大發射波長稍有紅移(從280 nm移至286 nm)，而色氨酸殘基的最大發射波長藍移(從280 nm移至276 nm)。表明配合物的加入使HSA的構象發生變化，酪氨酸殘基所處環境的疏水性增加，色氨酸殘基所處環境的疏水性降低。配合物分子的結合部位可能處于HSA亞結構域中圓筒狀的疏水腔內，導致HSA內部的疏水結構有一定程度的瓦解。NdL3·2H2O和NdL2L′·2H2O與HSA相互作用的同步熒光光譜與NdL′3·2H2O與HSA相互作用的同步熒光光譜類似。

2.6 紫外光譜

華法靈釹、水楊酸釹和華法靈水楊酸釹在260～300 nm范圍內無吸收。圖4為NdL2L′·2H2O配合物對HSA的紫外紫外吸收光譜的影響圖。隨著配合物的加入，HSA在278 nm處的吸收強度逐漸增強，并且峰位略微紅移3～4 nm。

HSA在278 nm處的吸收峰是其肽鏈上的酪氨酸和色氨酸的苯雜環π-π*躍遷引起的，吸收強度隨著配合物濃度的增加而加強，說明以上3種配合物與HSA發生了作用，從而誘導HSA分子鏈發生了類似降低pH值所出現的蛋白質肽鏈伸展現象[24]以至被包含在HSA內部的色氨酸和酪氨酸殘基的芳雜環疏水基團裸露出來，使吸收峰的強度增加，與此同時疏水基團之間的疏水作用減弱，由于HSA與加入的配合物生成了新的共軛體系，增加了新的π-π*躍遷，π-π*躍遷能量增大，使得吸收峰發生了略微的紅移。NdL3·2H2O 和 NdL′3·2H2O 與 HSA 相互作用的紫外光譜與NdL2L′·2H2O與HSA相互作用的紫外光譜類似。

2.7 HSA的構象變化

蛋白質的各種二級結構(α-螺旋、β-折疊、轉角、無規卷曲)在遠紫外圓二色譜(178～250 nm)區域存在特征峰[25]。如無規卷曲結構的特征峰為195 nm左右的1個負強峰(負科頓效應所對應)；而β-折疊的特征峰為217 nm處的1個負寬峰及198 nm處的1個正強峰(正科頓效應所對應)；對于α-螺旋則對應于 192 nm(正)、209 nm(負)以及 222 nm(負)3 個峰位置[26-27]。

由于HSA是具有光學活性的物質，因此通過測量它的CD圖譜，幫助我們了解它的構象,當加入配合物之后，通過觀察其CD圖譜的變化來進一步了解其結構的變化。

圖5所示，隨著配合物濃度的增加，HSA分子典型的二級結構α-螺旋在209 nm和222 nm處的負峰略微向低波數方向移動，并且相應的振幅也顯著地減弱。表明配合物與HSA分子發生了相互作用，從而使得HSA肽鏈伸展，影響了HSA的二級結構，導致了α-螺旋結構減少[28]。這個結果與配合物存在時HSA溶液的熒光光譜中的變化相一致。當配合物 NdL3·2H2O 濃度增大到 50 nmol·L-1時 (圖5A，d)，208 nm處負峰振幅繼續減小，222 nm處負峰的振幅反而增大，說明此時部分HSA分子在結構上發生了一些變化。當配合物NdL2L′·2H2O濃度增大到 25 nmol·L-1時(圖 5C，c)，也出現 208 nm 處負峰振幅繼續減小而222 nm處負峰的振幅增大的現象。通過計算得到圖5A中的α-螺旋結構由42.86%減少到22.30%；圖5C中的α-螺旋結構由42.86%減少到25.50%[29-30]。

3 結 論

通過熒光光譜分析得知，有抗凝血作用華法靈釹和華法靈水楊酸釹配合物對于HSA的猝滅效應屬于兩者之間生成了不發熒光的復合物而導致靜態猝滅，而水楊酸釹是動態猝滅與靜態猝滅兩種效應導致的猝滅。并確定了它們的結合力類型，華法靈釹(NdL3·2H2O)與HSA之間主要作用力是靜電作用力；水楊酸釹(NdL′3·2H2O)與 HSA 之間主要作用力為典型的疏水作用力；華法靈水楊酸釹(NdL2L′·2H2O)與HSA之間為氫鍵和范德華力。通過HSA溶液的同步熒光光譜、紫外吸收光譜和圓二色譜的變化可知，配合物的加入，影響了HSA的二級結構，導致α-螺旋結構減少。具抗凝血作用的NdL3·2H2O；NdL2L′·2H2O 和 NdL′3·2H2O 與 HSA 結合后，改變了HSA的構象，這對于研究血液中由血清白蛋白的構象變化而導致的溶解性變化與血栓的形成有著一定的啟示意義。

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