慢性心衰大鼠延髓頭端腹外側(cè)區(qū)GABAB 受體介導(dǎo)的心血管效應(yīng)

王仁俊，溫美玲，寇正涌，李 華，郝錫聯(lián)，趙 卓，周 革，周曉馥

（吉林師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林 四平 136000）

多種心血管疾病（冠心病、高血壓等）的終末階段都表現(xiàn)為慢性心力衰竭，是嚴(yán)重危害人類健康的心臟疾病.雖然臨床上采用β受體阻斷劑、腎素－血管緊張素醛固酮系統(tǒng)阻滯劑等對(duì)此有一定的治療作用，但其確診后四年病死率仍高達(dá)50%，目前仍缺乏有效的治療手段.

有研究顯示，慢性心衰的重要病理特征是交感傳出神經(jīng)興奮性增強(qiáng)［1］.導(dǎo)致心衰狀態(tài)下交感神經(jīng)興奮性增強(qiáng)的主要原因可能與中樞作用機(jī)制改變有關(guān)［2－5］.但是，在心衰狀態(tài)下延髓頭端腹外側(cè)區(qū)（RVLM）內(nèi)突觸遞質(zhì)與交感神經(jīng)活動(dòng)增強(qiáng)的確切機(jī)制目前還不清楚.眾所周知，延髓頭端腹外側(cè)區(qū)是調(diào)節(jié)交感緊張性的重要神經(jīng)核團(tuán)，許多神經(jīng)遞質(zhì)參與該部位的調(diào)節(jié)作用.目前認(rèn)為抑制性反應(yīng)主要是由γ－氨基丁酸（GABA）參與完成，并由GABAA和GABAB兩種受體介導(dǎo)，其中GABAB受體激活后通過G蛋白及第二信使系統(tǒng)，如cAMP或IP3介導(dǎo)K＋通道開放或Ca2＋通道關(guān)閉.在突觸后膜，K＋通道開放可誘導(dǎo)緩慢抑制性突觸后電位，而大多數(shù)分布在突觸前膜的GABAB受體主要通過關(guān)閉Ca2＋通道調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放.因此，無論在突觸前膜或突觸后膜的GABAB受體均參與介導(dǎo)抑制性效應(yīng).有研究表明RVLM的GABA緊張性抑制作用可通過GABAB受體產(chǎn)生［6］，而慢性心衰大鼠RVLM由GABAB受體介導(dǎo)的緊張性抑制作用是否發(fā)生改變，其內(nèi)在機(jī)制如何尚未見報(bào)道，本文對(duì)此進(jìn)行了研究，以探尋防治慢性心力衰竭的新策略和新方法.

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Wistar大鼠，雄性，體重180～200g，購自長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司.

1.2 藥品試劑與實(shí)驗(yàn)設(shè)備

試劑：阻斷劑CGP－35348、巴氯芬、α－氯醛糖、滂胺天藍(lán)購于Sigma－Aldrich公司；肝鈉素購于北京鼎國生物技術(shù)公司.設(shè)備：多道生理記錄儀、大鼠腦立體定位儀、微操縱器.

1.3 心衰動(dòng)物模型的建立

采用冠脈結(jié)扎方法誘導(dǎo)建立大鼠慢性心衰模型.在乙醚麻醉下將大鼠仰位固定于手術(shù)臺(tái)，自左側(cè)3～4肋間開胸，暴露心臟，于肺動(dòng)脈圓錐及左心房間找出冠脈左前降支，以0號(hào)線立即結(jié)扎冠脈；將心臟送回胸腔，并擠出胸腔內(nèi)血液和氣體，迅速關(guān)閉胸腔，開胸時(shí)間不超過30s.假手術(shù)組僅置縫線而不結(jié)扎冠脈.術(shù)后前3d，肌注青霉素.術(shù)后6～8周對(duì)假手術(shù)對(duì)照大鼠與心衰模型大鼠進(jìn)行數(shù)據(jù)檢測(cè).

1.4 實(shí)驗(yàn)分組

動(dòng)物隨機(jī)分為兩大組：（1）延髓頭端腹外側(cè)區(qū)微量注射GABAB受體阻斷劑CGP－35348組，其中分假手術(shù)組（n＝7）和心衰組（n＝8）.（2）延髓頭端腹外側(cè)區(qū)微量注射GABAB受體激動(dòng)劑巴氯芬組，其中分假手術(shù)組（n＝6）和心衰組（n＝8）.

1.5 左心室舒張末期壓（LVEDP）、左心室最大收縮舒張速率（±dp／dt）、血壓（BP）和心率（HR）的記錄

腹腔注射烏拉坦（0.75g／kg）和α－氯醛糖（70mg／kg）麻醉，如需要可靜脈補(bǔ)充α－氯醛糖（0.3g／kg）麻醉，右頸總動(dòng)脈插管，通過壓力換能器連接到多道生理記錄儀，同步采集LVSP（左心室收縮壓）、LVEDP和±dp／dt等各項(xiàng)指標(biāo)，記錄完左心室舒張末期壓后，將聚乙烯導(dǎo)管退出心室，可進(jìn)一步記錄動(dòng)脈血壓，記錄大鼠標(biāo)Ⅱ?qū)?lián)心電圖，并同步得到心率.

1.6 延髓頭端腹外側(cè)區(qū)微量注射及核團(tuán)定位

將動(dòng)物俯臥位固定于大鼠腦立體定位儀上，參照Paxions＆Waston大鼠腦圖譜［7］，在延髓頭端腹外側(cè)區(qū)（前囟后11.9～12.7mm，L和R 2.0～2.2mm，H 8.4～8.8mm）微量注射200nL相同體積的溶劑（vehicle）人工腦脊液（pH＝7.4），并先后分別微量注射200nL GABAB受體阻斷劑或激動(dòng)劑，從每次注射完成后開始計(jì)時(shí)，連續(xù)觀察BP和HR對(duì)微量注射藥物或人工腦脊液的反應(yīng)，每次給藥時(shí)間間隔30min.微注射實(shí)驗(yàn)完畢，用過量麻醉劑將動(dòng)物處死.將2%滂胺天藍(lán)溶液（50nL）緩慢注入延髓頭端腹外側(cè)區(qū).剪取頭顱，去除顱骨，將腦組織固定于10%甲醛溶液中，3d后作冰凍切片（厚度為30μm），染色，使用體視顯微鏡觀察藥物是否進(jìn)入延髓頭端腹外側(cè)區(qū)，定位偏離RVLM者不列入統(tǒng)計(jì).

1.7 心肌梗死面積測(cè)定

上述實(shí)驗(yàn)完成后取出心臟，－20℃保存.心肌梗死面積詳細(xì)測(cè)定步驟參見文獻(xiàn)［8］.

1.8 大鼠RVLM組織取材

用過量麻醉劑將假手術(shù)組和心衰組大鼠處死，取腦并迅速轉(zhuǎn)移至干冰上冰凍.用冰凍切片機(jī)在RVLM核團(tuán)所在位置連續(xù)切6張100μm厚的腦片，用12號(hào)針頭在腦片上RVLM核團(tuán)所在位置雙側(cè)總共打12個(gè)孔.針頭內(nèi)的組織即為RVLM核團(tuán)組織.

1.9 Western bolt檢測(cè)

取假手術(shù)組和心衰組大鼠RVLM內(nèi)腦組織分別加入蛋白提取緩沖液（10mmol／L Tris，1mmol／L EDTA，1%SDS，0.1%Triton X－100和1mmol／L PMSF），超聲粉碎，37℃孵育30min；4℃10000r／min離心2min；上清液即為全細(xì)胞蛋白，Bradford法測(cè)定蛋白濃度；各組等量蛋白樣品經(jīng)SDS－PAGE分離后，三明治法電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜；用封閉液（含5%脫脂奶粉TBST）室溫封閉；分別用一抗GABAB受體1a和1b亞型抗體（1∶500，rabbit polyclonal），GAPDH（1∶1000），室溫和4℃孵育過夜后，膜用TBST洗滌干凈.然后用1∶4000稀釋的紅外熒光標(biāo)記二抗（Alexa Fluor 800或Alexa Fluor 700）分別對(duì)膜避光孵育1h，利用Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)對(duì)膜上蛋白進(jìn)行檢測(cè).

1.10 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)都用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，注射前和注射后比較的數(shù)據(jù)分析使用配對(duì)t檢驗(yàn)做統(tǒng)計(jì)學(xué)處理.為比較BP和HR對(duì)微注射不同劑量激動(dòng)劑或阻斷劑的組內(nèi)差異，重復(fù)檢驗(yàn)ANOVA Dunnett's post hoc test.假手術(shù)組和心衰組之間原始數(shù)據(jù)和參數(shù)的相對(duì)改變采用二元ANOVA Bonferroni's post hoc test檢驗(yàn).

2 結(jié)果

2.1 心衰與假手術(shù)大鼠整體生理學(xué)指標(biāo)

大鼠心臟標(biāo)本病理分析發(fā)現(xiàn)，心衰組大鼠心臟重量、體重和肺濕重與假手術(shù)組相比明顯增加（P＜0.05），結(jié)果提示心衰大鼠出現(xiàn)水潴留.與肺淤血假手術(shù)組相比，心衰組大鼠左心室心肌梗死面積明顯增加（P＜0.05），心梗面積在30%～40%之間；假手術(shù)組大鼠左心室心肌未見明顯損傷.心衰組大鼠左心室最大收縮舒張速率（±dp／dt）明顯低于假手術(shù)組；而心衰組大鼠左室舒張末期壓卻明顯高于假手術(shù)組（P＜0.05）（見表1）.以上結(jié)果提示心衰組大鼠的心臟收縮和舒張功能減退，這些表現(xiàn)與臨床慢性心衰癥狀相近.

表1 心衰與假手術(shù)大鼠整體生理學(xué)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

2.2 注射GABAB受體阻斷劑CGP－35348

與溶劑對(duì)照組相比，假手術(shù)組和心衰組大鼠RVLM內(nèi)微量注射GABAB受體阻斷劑CGP－35348導(dǎo)致心率和血壓呈劑量依賴性升高（P＜0.05）（見圖1），但與假手術(shù)組相比，心衰組心率和血壓升高幅度顯著減小（P＜0.05）（見圖1）.心率和血壓對(duì)CGP－35348開始反應(yīng)的時(shí)間是2.5～3.5min，峰值出現(xiàn)在微量注射后的5～6min內(nèi)，而恢復(fù)至給藥前水平的時(shí)間是在20～25min內(nèi)，并且心衰組大鼠BP和HR的恢復(fù)時(shí)間為（22.1±1.9）min，與假手術(shù)組恢復(fù)時(shí)間（23.2±1.7）min無顯著差異（P＞0.05）.

圖1 假手術(shù)組與心衰組大鼠延髓頭端腹外側(cè)區(qū)微量注射CGP－35348對(duì)血壓和心率的影響

2.3 注射GABAB受體激動(dòng)劑巴氯芬

與溶劑對(duì)照組相比，假手術(shù)組和心衰組大鼠延髓頭端腹外側(cè)區(qū)微量注射GABAB受體激動(dòng)劑巴氯芬導(dǎo)致心率、血壓呈劑量依賴性下降（P＜0.05）（見圖2）；但與假手術(shù)組比，心衰組心率和血壓下降幅度顯著減小（P＜0.05）（見圖2）.心率和血壓對(duì)巴氯芬產(chǎn)生反應(yīng)的谷值出現(xiàn)在微量注射后的4～5min內(nèi)，而心率和血壓下降的效應(yīng)在微量注射后的25～35min內(nèi)恢復(fù)至給藥前的基線水平，并且心衰組大鼠BP和HR對(duì)延髓頭端腹外側(cè)區(qū)微量注射GABAB受體激動(dòng)劑巴氯芬產(chǎn)生反應(yīng)的潛伏期（3.9±0.8）min，與假手術(shù)組潛伏期（4.1±0.7）min無明顯差異（P＞0.05）.

圖2 假手術(shù)組與心衰組大鼠延髓頭端腹外側(cè)區(qū)微量注射巴氯芬對(duì)血壓和心率的影響

2.4 檢測(cè)大鼠RVLM內(nèi)GABAB受體1a和1b亞型蛋白表達(dá)量

因?yàn)?a和1b兩種亞型是GABAB受體的主導(dǎo)優(yōu)勢(shì)亞型［9－10］，故分別在6只假手術(shù)組和6只心衰組大鼠中，使用Western bolt技術(shù)檢測(cè)假手術(shù)組、心衰組大鼠RVLM內(nèi)GABAB受體1a和1b亞型蛋白表達(dá)量.研究結(jié)果顯示心衰組大鼠RVLM內(nèi)GABAB受體1a和1b亞型蛋白表達(dá)量與假手術(shù)組相比發(fā)生下調(diào)（P＜0.05）（見圖3）.

圖3 假手術(shù)組與心衰組大鼠延髓頭端腹外側(cè)區(qū)GABAB受體1a和1b亞型蛋白表達(dá)量

3 討論

本項(xiàng)研究工作證實(shí)心衰大鼠RVLM內(nèi)GABAB受體介導(dǎo)的交感緊張性調(diào)節(jié)作用減弱.在大鼠單側(cè)RVLM微量注射GABAB受體激動(dòng)劑巴氯芬導(dǎo)致BP下降和HR減慢，這可能是微量注射GABAB受體激動(dòng)劑巴氯芬后，交感神經(jīng)的傳出活動(dòng)受到抑制而引發(fā)的，該結(jié)果與Amano等人的報(bào)道相一致［11］.相比較而言，于大鼠RVLM微量注射GABAB受體阻斷劑CGP－35348，卻引起HR加快、BP升高，這可能是與微量注射GABAB受體阻斷劑后，交感神經(jīng)的傳出活動(dòng)去抑制有關(guān)，該結(jié)果與周蘇婭等人的報(bào)道相一致［6］.值得注意的是與假手術(shù)組相比，心衰組RVLM微量注射GABAB受體阻斷劑后心率、血壓升高幅度顯著降低，而微量注射GABAB受體激動(dòng)劑巴氯芬使心率、血壓下降幅度顯著減少，結(jié)果提示心衰大鼠RVLM的GABAB受體介導(dǎo)的緊張抑制作用發(fā)生鈍化.這種RVLM的GABAB受體介導(dǎo)的交感縮血管緊張抑制作用的功能減弱可能是使交感神經(jīng)興奮性增強(qiáng)的作用機(jī)制之一.

為進(jìn)一步解釋心衰大鼠RVLM內(nèi)GABAB受體功能減弱的確切機(jī)制，本文進(jìn)行了Wertern blot檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，Western blot結(jié)果顯示心衰大鼠RVLM的GABAB受體介導(dǎo)的緊張性抑制作用發(fā)生鈍化，與GABAB受體的表達(dá)量下調(diào)有關(guān).此外，心衰大鼠RVLM GABAB受體功能減弱存在以下幾種可能機(jī)制：（1）在慢性心衰狀態(tài)下，某些激素或神經(jīng)遞質(zhì)水平升高，可降低RVLM內(nèi)GABAB受體的功能.（2）受體的親和力、磷酸化狀態(tài)以及亞基的組成可能與心衰大鼠RVLM內(nèi)GABAB受體功能減弱有關(guān).（3）幾種突觸遞質(zhì)效應(yīng)如：突觸前GABA合成或釋放的減少、GABA降解的增加以及GABA與其受體的異常作用都可能導(dǎo)致GABAB受體功能的改變，進(jìn)而引起交感興奮性增強(qiáng).（4）心衰狀態(tài)下一氧化氮（NO）－GABA機(jī)制也可影響交感神經(jīng)的緊張性作用.

根據(jù)組織學(xué)鑒定，我們認(rèn)為在RVLM內(nèi)微量注射GABAB受體激動(dòng)劑或阻斷劑所引起的BP和HR的改變，都是RVLM內(nèi)特異性的，即這些效應(yīng)并不是注射時(shí)的機(jī)械刺激或酸堿化學(xué)刺激所致，因?yàn)槲⒘孔⑸湎嗤w積的人工腦脊液（pH＝7.4），對(duì)BP和HR均無明顯影響.同時(shí)該效應(yīng)與藥物擴(kuò)散達(dá)到RVLM鄰近部位也無關(guān)，因?yàn)橄騌VLM鄰近部位注入相同體積和pH值的GABAB受體激動(dòng)劑或阻斷劑，對(duì)BP和HR并無明顯影響；并且該效應(yīng)也非藥物進(jìn)入血液循環(huán)作用于其他外周器官組織所引發(fā)，因?yàn)槲覀冎苯酉蜢o脈內(nèi)注射了2.5倍于RVLM內(nèi)微量注射最高劑量濃度的GABAB激動(dòng)劑或阻斷劑，發(fā)現(xiàn)BP和HR均未發(fā)生顯著變化.

總之，本研究顯示慢性心衰狀態(tài)下RVLM內(nèi)GABAB受體介導(dǎo)的交感傳出抑制作用發(fā)生鈍化與GABAB受體的表達(dá)量下調(diào)有關(guān)，結(jié)果提示RVLM內(nèi)GABAB受體功能的減弱和GABAB受體的表達(dá)量下調(diào)是心衰狀態(tài)下心血管功能異常（如交感興奮性增強(qiáng)等）的重要病理機(jī)制之一.

［1］COHN J N，LEVINE T B，OLIVARI M T，et al.Plasma norepinephrine as a guide to prognosis in patients with chronic congestive heart failure［J］.N Engl J Med，1984，311：819－823.

［2］ZHANG K，LI Y F，PATEL K P.Reduced endogenous GABA－mediated inhibition in the PVN on renal nerve discharge in rats with heart failure［J］.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2002，282（4）：1006－1015.

［3］WANG REN－JUN，ZENG QING－HUA，WANG WEI－ZHONG，et al.GABAAand GABABreceptor－mediated inhibition of sympathetic outflow in the paraventricular nucleus is blunted in chronic heart failure［J］.Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology，2009，36（5）：516－522.

［4］王仁俊，寇正涌.運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練改善心衰大鼠室旁核GABAA受體介導(dǎo)的交感傳出抑制作用［J］.東北師大學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2009，41（3）：107－113.

［5］王仁俊，韓俊杰.運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練改善心衰大鼠室旁核GABAB受體介導(dǎo)的交感傳出抑制作用［J］.吉林師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2009，30（1）：65－68.

［6］周蘇婭，黃德明，陳應(yīng)城.延髓頭端腹外側(cè)區(qū)調(diào)節(jié)心血管活動(dòng)的γ－氨基丁酸機(jī)制［J］.浙江醫(yī)科大學(xué)報(bào)，1998，27（5）：193－196.

［7］PAXIONS G，WATSON C.The rat brain in stereotoxic coordinates［M］.New York：Academic Press，1986.

［8］徐叔云，卞如濂，陳修.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)（第二版）［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1994：921－922.

［9］BETTLER B，KAUPMANN K，MOSBACHER J，et al.Molecular structure and physiological functionsof GABA（B）receptors［J］.Physiol Rev，2004，84（3）：835－867.

［10］MARGETA－MITROVIC M，MITROVIC I，RILEY R C，et al.Immunohistochemical localization of GABA（B）receptors in the rat central nervous system［J］.J Comp Neurol，1999，405（3）：299－321.

［11］AMANO M，KUBO T.Involvement of both GABAAand GABABreceptors in tonic inhibitory control of blood pressure at the rostral ventrolateral medulla of the rat［J］.Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol，1993，348（2）：146－153.