高壓酶解大米蛋白抗氧化活性及其分子質量分布

王章存 崔勝文 袁道強 趙學偉 安廣杰 李樂靜

(鄭州輕工業學院食品與生物工程學院，鄭州 450002)

蛋白質酶解后產生的小分子肽不僅更容易被人體吸收，還具有不同的生物活性［1］，如提高免疫力、抗氧化、抗疲勞、止疼、鎮靜等，甚至在化妝品中也有很大的的應用潛力。其中抗氧化活性肽因有利于對預防和治療自由基誘發的各種疾病而備受關注［2］。

大米蛋白是公認的優質植物蛋白，不僅氨基酸組成合理，還具有抗糖尿病、抗膽固醇等重要的保健功能［3］。大米蛋白酶解物也表現出良好的抗氧化活性［2，4］。因此，開發利用大米蛋白質資源具有重要意義。通過傳統的堿溶酸沉法直接從大米胚乳中提取蛋白質有一定的經濟局限性［5］。大米淀粉糖生產中有大量的副產品——俗稱米渣蛋白，但因在淀粉糖生產中，大米蛋白受到了高溫處理而發生了聚集作用，在水中的溶解性較差，常規酶解方法也只能使約50%的大米蛋白溶解［5］。

大量研究表明，高壓處理可以改變蛋白質顆粒的聚集狀態和高級結構，從而影響蛋白質的功能性質，也影響蛋白質的酶解模式［6－8］。例如，胃蛋白酶難以水解 β－乳球蛋白(β－Lg)，但 β－Lg經過200 MPa高壓處理后很容易被該酶水解［9］;經600 MPa處理后，可在1 min內被水解成1 500 u以下的小分子［10］。卵清蛋白經200 MPa高壓處理后，用胰凝乳蛋白酶水解可加速釋放具有降血壓作用的3種活性肽［11］。大豆蛋白經400 MPa處理20 min后，其堿性蛋白酶水解抗氧化活性均高于未高壓處理的酶解物［12］。

高壓處理也可改變大米蛋白的結構，并提高其溶解性［13］。本試驗研究大米蛋白經不同高壓預處理后再用堿性蛋白酶水解所得產物的抗氧化活性，用正交試驗法優化了酶解條件，并分析了酶解產物的分子質量分布等，為大米蛋白活性肽的進一步分離純化和構效關系研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

大米分離蛋白(凱式定氮法測定其粗蛋白質量分數75.6%):湖北漢科生物科技公司;堿性蛋白酶Alcalase 2.4L:諾維信公司;其他試劑為分析純。

1.2 主要儀器

UHP900×2－Z高壓設備:包頭文天科技公司;LC600高效液相色譜儀、UV8100B紫外可見光分光光度計:Lab－Tech公司;TSK gel G2000 SWXL凝膠色譜柱(7.8×300 mm):日本TOSOH公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品高壓處理

分別準確稱取大米蛋白10.0 g懸浮于100 mL的pH 8.0水溶液中，裝入兩層聚乙烯塑料袋(8 cm×10 cm)中真空密封(不留頂隙)，置于高壓裝置內腔，浸沒于加壓介質中，于25℃、壓力300、500 MPa下分別處理10 min。升壓、降壓均在1 min內完成。

1.3.2 酶解試驗

在高壓處理后的樣品(pH 8.0)中加入堿性蛋白酶Alcalase后，單因素試驗確定反應因素及其水平后，再按照正交試驗(表1)的條件反應，其間滴加1 mol/L NaOH溶液維持pH的穩定。反應結束后，于100℃沸水浴中滅酶10 min，2 000 r/min離心10 min，將上清液適當稀釋后測定其還原能力。

1.3.3 還原能力的測定

參考 Oyaizu 方法［14］，并略做修改。用pH 6.6 磷酸鹽緩沖液稀釋成不同濃度梯度，各取1 mL不同濃度的大米蛋白水解物，分別加入2.5 mL，pH 6.6磷酸鹽緩沖液，2.5 mL 1%鐵氰化鉀，混合后于50℃恒溫20 min，再加入 2.5 mL 10% 三氯乙酸，然后3 000 r/min離心10 min，取上層清液加2.5 mL蒸餾水和0.5 mL的0.1%FeCl3溶液。混勻后于700 nm處測定吸光度值。每一樣品進行3次重復。吸光值越高，表明酶解物的還原性越強。

1.3.4 酶解物分子質量測定

采用高效液相色譜法分析。色譜柱TSK gel G2000 SWXL(7.8 ×300 mm);流動相為乙腈∶水∶三氟乙酸(TFA)=45∶55∶0.1，檢測波長 220 nm，柱溫25℃;流速1.0 mL/min，上樣量10μL。以標準品細胞色素C(M r 12 500)，抑肽酶(M r 6 500)，桿菌酶(M r 1 450)，乙氨酰－乙氨酰－酪氨酰－精氨酸(M r 451)和乙氨酰－乙氨酰－乙氨酸(M r 189)做分子質量校正曲線。

1.3.5 數據統計

應用SPASS軟件對數據進行處理。

2 結果和討論

2.1 酶解條件的優化

對3種不同高壓處理的大米蛋白分別進行不同底物濃度(A)、反應溫度(B)、加酶量(C)和反應時間(D)的單因素酶解試驗。在此基礎上，采用L9(34)正交試驗及相應的因素和水平(表1)進行試驗，測定了不同壓力處理和酶解條件下酶解物的抗氧化活性(此處以還原力表示)。試驗結果如表2所示。

通過分析可知，經過不同壓力處理的大米蛋白在相同酶解條件下制備的酶解物不僅還原力大小不同，而且隨著酶解條件的變化，還原力變化趨勢也有差異。極差分析表明，未經高壓處理的大米蛋白酶解時，影響酶解物還原力大小的主次因素依次為CABD(即加酶量、反應溫度、反應時間和底物濃度)，經300、500 MPa高壓處理者的主次因素分別依次為CDAB、CABD。上述結果表明，高壓處理影響了大米蛋白的結構，進而影響了它的酶解特性，因而相同條件下產生不同的多肽分子。這與文獻中其他蛋白高壓處理后的酶解特點有相似性［8，10］。

表1 因素和水平表

表2 正交試驗L9(34)及結果

統計結果顯示，未高壓處理大米蛋白的最佳酶解條件組合A2B2C2D3，即料液底物質量分數5%，反應溫度55℃、加酶量1%、反應時間120 min，在此條件下制備的大豆蛋白酶解物的還原力達到0.125。同理，經過300、500 MPa高壓預處理大米蛋白的酶解最佳條件組合分別為A2B1C2D3和A1B2C3D2，在該條件下的放大試驗的酶解物還原力結果分別為0.149和0.158，均高于正交試驗表中的相應處理的最大值，表明優化條件可靠。

2.2 分子質量分布

為了探討大米蛋白肽抗氧化活性的分子基礎，將前述優化條件下的酶解物用高效液相色譜進行分離(圖1)。可知，不同酶解物的分子質量范圍差別不大，如最大分子質量均為14.3 ku，最小分子質量為300 u。不同分子質量組分的相對含量卻明顯不同(表3)。未高壓處理的對照組中，10～15 ku、1～10 ku和1 ku以下等3段分子質量組分所占比例分別為26.6%、46.9%、26.5%;300 MPa 預處理組中3 段分子質量組分的質量分數分別為16.5%、39.3%和44.2%;500 MPa組中的質量分數分別為11.8%、33.1%和55.1%;其分子質量大小與作者前期研究高壓處理更利于大米蛋白酶解的結論相吻合［12］。結合其還原力結果的分析表明，不同處理條件下大米蛋白酶解物的還原力大小與其分子質量的分布之間有明顯的關聯性，即3種酶解條件下隨著小分子肽含量的比例增加，抗氧化活性也增大。這與文獻中其他蛋白的酶解現象有相似之處［15－16］。據報道，多種蛋白的酶解物中小分子質量肽的抗氧化活性均比大分子組分的活性高，如小麥面筋蛋白中性蛋白酶物3 ku以下小麥肽［15］、大豆蛋白酶解物中5 ku以下的大豆肽［16］等組分具有較高的抗氧化活性。

圖1 不同壓力條件預處理大米蛋白酶解物的HPLC分析圖譜

表3 不同壓力預處理酶解物的分子質量分布及其相對含量

3 結論

研究表明，高壓預處理大米蛋白有利于酶解產生更高抗氧化活性的大米肽，300 MPa和500 MPa處理者活性分別比未處理者提高19.2%和26.4%。當酶解條件變化時，不同壓力預處理者酶解物活性的變化趨勢也不一致，反映了其活性肽組分之間的差異。HPLC分析顯示，經300 MPa和500 MPa高壓處理后的酶解物中分子質量1 ku以下小肽的相對含量分別為44.2%和55.1%，而未高壓處理者該組分只有26.5%，可見，高壓處理有利于大米蛋白酶解產生小分子的活性肽。

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