麥苗中阿魏酸、抗壞血酸(VC)、總黃酮協同抗氧化能力分析

張志清 向建軍 周利茗 蒲 彪

(四川農業大學食品學院，四川雅安 625014)

麥苗作為一種中國傳統的中草藥，其功效在《本草綱目》《得配本草》《傷寒類要》等中國傳統醫學典籍中都有詳細記載［1］。現代醫學研究表明，麥苗有減肥、降脂、抗氧化、抗炎癥、抗潰瘍、降低膽固醇、降血糖、抗皮膚過敏等重要功效［2－3］。國外對麥苗的開發與利用從19世紀開始，美國人安·威格摩爾創立了以麥苗為主的“生食療法”。近年來麥苗作為功能食品的研究在我國逐漸得到關注［4］。研究表明，麥苗中含有多種人體必需的氨基酸，豐富的抗氧化成分，如VC、VE、黃酮化合物、多酚等，表現出較高的抗氧化活性［5］。施瑛等［6］采用亞油酸法測得麥苗抗氧化活性分別是BHT、α－生育酚的4.9倍和7.2倍;黃嘌呤氧化酶法測得其SOD活性是葡萄的7倍，并且有一定的GSH－Px活性和自由基清除活性。

抗氧化協同效應是指通過對不同抗氧化物之間進行優選和配方處理，可以獲得比單一抗氧化劑高得多的抗氧化能力，提高生物體的氧化穩定性［7］。Tappel等［8］在1962年對VC和VE協同作用的研究中就提出了VC再生VE的觀點。王岳飛等的研究表明不同濃度的茶多酚和西洋參之間存在一定的協同增效作用［9］。劉中立等［10］證實了茶多酚與VE的協同抗氧化。普遍存在于麥苗中的阿魏酸、黃酮物質、抗壞血酸都有較高的抗氧化活性，但是這3種抗氧化活性物質在小麥中的協同抗氧化研究依然鮮見。本研究根據麥苗中3種抗氧化組分含量測定數據為基礎，通過標準品配置不同濃度的標準溶液，模擬含量水平相互復配組合，分析抗氧化能力，以期研究麥苗中各組分的協同抗氧化作用，了解麥苗的抗氧化活性特點，為麥苗的開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

小麥品種川麥107，葉片采樣按小麥苗生長期計，每次取樣10～15株。

反式阿魏酸(Ferulic Acid，FA，純度 ＞99%);抗壞血酸(Ascorbic Acida，AA，純度 ＞99.9%:德國SIGMA－ALDRICH公司;蘆丁(總黃酮測定對照，純度 ＞99.9%);DPPH，ABTS(純度≥99.0%):成都杰銳生物科技有限公司分裝。

LC－10A高效液相色譜儀(配紫外檢測器):日本島津公司Milli－Q型純水儀:美國密理博公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 麥苗中3種抗氧化組分的測定方法

分別測定小麥葉片中阿魏酸，抗壞血酸，以及總黃酮在2011年1月～3月中總共10個時期(采樣次數)的含量，抽穗后停止采樣。

抗壞血酸測定采用GB/T 5009.86—2003中2，4－二硝基苯肼法［11］;總黃酮含量采用乙醇超聲提取，360 nm處吸光度［12］;阿魏酸含量采用高效液相色譜法進行測定［13］。

1.2.2 抗氧化活性測定方法

參考郭文莉等［14］和 Roberta 等［15］的方法，采用DPPH法和ABTS法分別測定單一組分以及組配混合物的抗氧化活性。

麥苗汁總抗氧化活性測定取新鮮麥苗20 mg于離心管中，按上述方法測定DPPH·和ABTS+·清除率，分析麥苗汁總抗氧化活性。同時，將濃度為40、60、80、100、120、160、200 μg/mL 抗壞血酸標準液作為抗氧化活性的陽性對照。

1.2.3 協同抗氧化能力的分析

1.2.3.1 單一組分的抗氧化活性的測定

分別配制濃度為 1、2、4、6、8 μg/mL 的抗壞血酸、蘆丁、阿魏酸標準溶液，按1.2.2分別測定抗氧化活性。

1.2.3.2 兩組分間的協同抗氧化活性的測定

每種抗氧化物質取3個濃度:1、2、4μg/mL，每兩種物質之間3種濃度兩兩組合，配制復合溶液，按1.2.2測定復合溶液的抗氧化活性。

1.2.3.3 3 組分間的協同抗氧化活性

對抗壞血酸、蘆丁、阿魏酸分別取1、2、4μg/mL 3個濃度水平進行三因素三水平的析因設計試驗，考察組合溶液對DPPH·的清除率。

上述試驗每組平行測定3個樣品，通過SPSS 18.0分析軟件對試驗結果進行直接比較分析、析因分析和回歸分析，結合1.2.2對麥苗汁總抗氧化活性測定結果分析3組分間的協同抗氧化活性。

2 結果與分析

2.1 小麥苗中3種抗氧化組分在不同時期含量變化

本研究測定分析了在1月～3月小麥葉片中的阿魏酸，抗壞血酸，以及總黃酮的含量及變化趨勢(圖1)。結果表明，總黃酮含量明顯高于阿魏酸和抗壞血酸含量，平均達到773.78 mg/100 g，其變化范圍在676.37 ～855.77 mg/100 g波動，其變化趨勢是先增加，在2月中旬有所降低，隨后在3月中旬到達最高，其原因可能與各類黃酮類物質間轉換有關。在2～3月期間，田間溫度迅速回升，有利于麥苗生物產量的增加和功能物質的積累，表明總黃酮可能是小麥苗中主要的抗氧化成分。

圖1 麥苗中阿魏酸(FA)，抗壞血酸(AA)，總黃酮含量變化

在3種物質中，阿魏酸平均含量最低，僅為34.07 mg/100 g(變幅 25.9 ～52.4 mg/100 g)，而且隨苗期變化幅度較小，呈緩慢增加。阿魏酸是近年來研究較多的抗氧化物質，在多種植物中均存在，但是本研究中小麥苗阿魏酸含量較低。抗壞血酸平均含量 146.51 mg/100 g，最高為 226.29 mg/100 g，此時期為幼苗期(2月初)田間尚未拔節和分蘗，柔嫩的小麥葉片中抗壞血酸含量較高，隨著生育期延長，麥苗中纖維素、木質素增加，其抗壞血酸含量降低，最低僅為 104.02 mg/100 g。

2.2 麥苗汁的抗氧化活性

稱取25 mg新鮮麥苗于10 mL離心管中，用玻璃棒搗碎后加入DPPH·或ABTS+·反應體系7或20 mL，然后測定濾液的吸光值。由于吸光度較大清除率DPPH清除率在80% ～90%之間，而ABTS+·清除率接近100%，無法以濃度梯度計算其IC50值。因此試驗將麥苗汁用超純水稀釋定容至50 mL，然后測定量效關系，分別取 1、2、4、5、6、8 mL 樣品溶液用蒸餾水定容于10 mL容量瓶中，然后分別用DPPH和ABTS測定法其抗氧化活性，結果見圖2。同法測定麥苗汁在10個不同時期的抗氧化能力(圖3)。

圖2 麥苗汁稀釋液抗氧化性的量效關系變化

圖3 不同采樣時期麥苗汁抗氧化活性

從圖2可以明顯的看出，隨著所用麥苗汁稀釋液體積的加大，其抗氧化能力明顯加強，呈現出一定的量效關系，但線性關系不明顯。當反應液中麥苗汁體積為2 mL DPPH·清除率即達到83.23%，此時ABTS+·的清除率也達到了69.49%，表現出較強的抗氧化活性，隨著麥苗汁稀釋液的體積的增加在4 mL時，抗氧化活性達到最大值，此時清除率分別為86.45%和88.63%。對比抗壞血酸標準液對DPPH·和ABTS+·的清除率(表1)可知，20 mg的麥苗制成的麥苗汁稀釋液4 mL對DPPH·和ABTS+·的清除率就可達80%以上，相當于200μg/mL的抗壞血酸2 mL(即0.4 mg)抗壞血酸對DPPH·和ABTS+·的清除率，說明麥苗汁具有較強的抗氧化能力。

表1 抗壞血酸標準液對DPPH·和ABTS+·的清除率

按上述方法將10個采樣時期的20 mg新鮮小麥葉片榨汁，稀釋并以2 mL加入反應體系中。麥苗汁隨生長周期的變化清除DPPH·和ABTS+·的變化趨勢表明(圖3)，麥苗汁清除DPPH·能力隨小麥苗生長周期的變化而呈上升趨勢，麥苗汁ABTS+·清除率變化趨勢較DPPH·清除率上升趨勢不明顯，僅從1月底的81.20%上升到3月底(第10次采樣)94.74%，增加幅度為13.54%。而ABTS+·的清除率則從1月底的43.90%，急劇增加到92.14%，其在小麥苗期，表現出較強的抗氧化活性，其平均ABTS+·和DPPH·清除率分別達到90.76%和74.34%。

2.3 小麥苗中3種抗氧化組分的協同抗氧化作用分析

為了解苗期小麥葉片中3種抗氧化組分對抗氧化活性的協同作用特點，本研究用抗壞血酸、阿魏酸、蘆丁3種標準物質對協同抗氧化能力進行分析。并結合上述麥苗汁抗氧化分析結果，采用直觀分析、析因分析和回歸分析研究組分間的協同作用。

2.3.1 單一組分的抗氧化活性分析

由圖4可知，單一組分具有較高的抗氧化能力，且抗氧化能力與濃度呈正相關。在低濃度時，蘆丁對DPPH·的清除率比相同濃度的抗壞血酸和阿魏酸要強，對ABTS+·的清除率強于抗壞血酸，但比阿魏酸要弱;隨著濃度的增加，抗壞血酸對DPPH·的清除率增大，且要強于蘆丁和阿魏酸;隨著濃度的變化，阿魏酸對ABTS+·的清除率始終強于抗壞血酸和蘆丁，當質量濃度為 8.0 μg·mL－1時，其對ABTS+·的清除率達到86.24%，但其對DPPH·的清除率則較低。抗壞血酸的清除能力在質量濃度大于2.5μg·mL－1時逐漸比蘆丁強，這可能與它們的結構以及抗氧化機理有關，不同抗氧化劑提供氫的羥基位置不同，其活潑程度不同，所以抗氧化性能不同。

圖4 各組分對DPPH·和ABTS+·的清除率

2.3.2 組分間的協同抗氧化活性分析

分別配制1、2、4 μg·mL－1的 3種不同抗氧化劑，并且兩兩組合為混合溶液，應用DPPH法和ABTS法測其抗氧化能力，結果如表2所示。由表2可知，抗壞血酸與蘆丁的混合溶液對DPPH·和ABTS+·的清除率均比單一組分清除率之代數和低，但大于各單一組分清除率。因此，抗壞血酸與蘆丁具有協同抗氧化作用。當抗壞血酸濃度不變時，組合溶液對自由基的清除率與蘆丁的濃度呈正相關變化。當蘆丁濃度不變時，復配溶液對自由基的清除率與抗壞血酸的濃度未呈現明顯相關性。由此可知，蘆丁對總抗氧化能力的作用大于抗壞血酸。

抗壞血酸與阿魏酸的混合溶液對DPPH·和ABTS+·的清除率均比單一組分清除率的代數和高，即抗壞血酸與阿魏酸的協同抗氧化活性大于其單一組分之和。但是當抗壞血酸濃度較高時，抗壞血酸與阿魏酸的混合液對DPPH·的清除率略小于單一組分代數和，但均大于各單一組分對DPPH·的清除率。當阿魏酸或抗壞血酸的濃度不變時，混合液對自由基的清除率隨抗壞血酸或阿魏酸的濃度升高而升高。可見，抗壞血酸與阿魏酸的組合溶液的協同抗氧化性比抗壞血酸與蘆丁溶液組合的協同抗氧化性高。

表2表明，除當阿魏酸質量濃度為1μg·mL－1的復配溶液對ABTS+·清除率大于單一組分清除率的代數和外，阿魏酸與蘆丁的復配溶液對DPPH·和ABTS+·的清除率均小于其單一組分清除率之代數和，但均大于各單一組分的清除率。即阿魏酸與蘆丁具有協同抗氧化作用。同時，當一種組分濃度不變時，復配溶液對自由基清除率與另一組分濃度的呈正相關變化。阿魏酸濃度變化對抗氧活性的影響大于蘆丁的影響，即阿魏酸對抗氧化能力的作用大于蘆丁。綜上表明，相同濃度下，3種組合中阿魏酸與抗壞血酸的復配溶液對自由基的清除率最大，其次是阿魏酸與蘆丁的復配溶液，最后是抗壞血酸與蘆丁的復配溶液。

表2 不同抗氧化劑組合溶液對DPPH·和ABTS+·的清除作用

分別配制1、2、4μg/mL的抗壞血酸、蘆丁、阿魏酸標準組合溶液，測其抗氧化能力，結果如表3所示。當兩種組分濃度不變時，復配組分對自由基的清除率與第3種組分的濃度呈正相關;當蘆丁質量濃度為1μg/mL時，復配組分對DPPH·和ABTS+·的清除率小于各單一組分清除率之代數和;當蘆丁質量濃度為2和4μg/mL時，復配組分對DPPH·和ABTS+·的清除率均大于各單一組分清除率之代數和，說明蘆丁在高濃度時，其協同抗氧化能力更強。復配組分對自由基的清除率均大于單一組分的清除率，說明抗壞血酸、阿魏酸、蘆丁之間存在協同抗氧化效應。根據試驗結果，當抗壞血酸、阿魏酸、蘆丁的質量濃度均為4μg·mL－1時，復配組分對DPPH·和ABTS+·的清除率達到最大，分別為52.86%和76.47%，當抗壞血酸、阿魏酸、蘆丁的質量濃度分別為 1、1、4 μg·mL－1時，3 組分對 DPPH·的清除率比單一組分代數和的清除率提高62.9%;當抗壞血酸、阿魏酸、蘆丁的質量濃度分別為 2、2、4 μg·mL－1時，3組分對ABTS+·的清除率比單一組分清除率代數和提高8.9%。對比兩兩組合的復配溶液，相同濃度下，3組分混合液對自由基的清除率有明顯提高，即3種物質的協同抗氧化能力大于其中任何兩種抗氧化物質的組合。

2.3.3 組分間的協同抗氧化活性的析因分析

本研究對3標準組分的抗氧化能力及協同抗氧化能力采用析因設計，該法可檢驗每個因素各水平間的差異，以及各因素間的交互作用［16］。每組分取3 個水平:1.0、2.0、4.0 μg·mL－1，每個組合重復 2次，對結果采用SPSS軟件進行處理，方差分析結果如表4所示。由表3可知，3組分的 P=0.000＜0.05，說明3組分的濃度不同，抗氧化能力的大小也不同;對于一階交互效應，3者的 P=0.000＜0.05，說明3組分間兩兩之間均存在交互作用，兩兩之間均對彼此的抗氧化能力存在顯著影響;對于二階交互效應，P=0.000＜0.05，說明3組分存在顯著的交互作用。

表3 3組分組合對DPPH·和ABTS+·的清除作用

表4 析因試驗結果方差分析表

2.3.4 組分間的協同抗氧化活性的回歸分析

以混合物對DPPH·的清除率為因變量Y，抗壞血酸、阿魏酸和蘆丁的濃度為自變量X1、X2和X3，采用SPSS軟件對數據進行逐步回歸分析。模型輸出結果如表5所示。隨著自變量被逐步引入回歸方程，回歸方程的相關系數R和決定系數R2在逐漸增大，說明引入的自變量對總清除率的作用在增加。其中決定系數R2=0.830，則剩余因子=0.312，該值較大，說明對清除率有影響的自變量不僅有以上3種物質，還有一些影響較大的因素沒有考慮到，還有待于進一步研究。

表5 逐步回歸模型分析

用spss軟件對模型進行回歸分析表明，線性回歸方程為:y= －1.879+3.167x1+2.673x2+7.920x3。自變量x1、x2、x3對 Y的作用的標準回歸系數分別是:P1y=0.323，P2y=0.272，P3y=0.807，即 3 種物質對總清除率的影響大小是:蘆丁﹥抗壞血酸﹥阿魏酸。即蘆丁對總抗氧化能力的貢獻率最大，抗壞血酸次之，阿魏酸最小。顯著性檢驗結果表明，x1、x2、x3的偏回歸系數的顯著性均小于0.05，說明自變量與因變量之間存在顯著性差異。經偏回歸系數的顯著性檢驗表明，3者之間存在著極顯著地交互作用(P＜0.01)，即3者有著顯著地協同抗氧化作用。

3 討論

已有研究表明［17－19］，麥苗中抗壞血酸、阿魏酸、總黃酮的含量分別為 168.41、37.6、770.0 mg/100 g，三者含量比約為22∶5∶1，綜合以上結論分析，麥苗對DPPH·的清除率將在30%左右，而對ABTS+·的清除率將在60%左右。因此，麥苗中的抗氧化組分具有協同抗氧化作用，且抗氧化能力較高。

抗氧化活性大小與抗氧化劑分子中酚羥基數目及新生成自由基的穩定性呈正相關。不同抗氧化劑提供氫的羥基位置不同，其活潑程度不同，所以抗氧化性能不同。不同抗氧化劑復配使用時，其抗氧化效果優于單獨一種抗氧化劑的抗氧化效果，這是因為兩種或兩種以上的抗氧化劑復配使用時，各種抗氧化劑在抗氧化之后，產生的游離基會相互作用生成新的酚類化合物，繼續發揮抗氧化作用，使其抗氧化性能得以增強［20］。1962年，Tappel率先開展了VE與VC間協同作用的研究，并提出了VC再生VE的觀點。除此之外，其它抗氧化劑間的協同作用也有文獻報道如兒茶素與VC、VE共同使用對豬油抗氧化有明顯的協同增效作用［21］。

抗氧化的機理研究表明，抗氧化劑作用機理并不完全相同。有的提供質子，捕獲自由基，而本身形成穩定的共振結構而阻斷氧化(如黃酮類化合物);有的與氧作用而消耗密閉系統中殘留的氧(如VC及其鹽類);有的可與金屬離子形成螯合物，減少金屬離子對氧化作用的催化活性(如檸檬酸、植酸等);有的能破壞單旋態氧(1O2)而抑制光氧化的進行(如胡蘿卜素)等等。如將這些具有不同抗氧化性能的物質混合在一起，抗氧化的整體效果自然要增強。另外，不同抗氧化劑共同使用時，抗氧化劑自由基之間可能互相還原，使抗氧化劑再生［21］。因此，協同抗氧化作用既不是各種抗氧化劑抗氧化作用的簡單加合，也不是它們的相乘關系，而是各種抗氧化劑在抗氧化作用不同方面發揮作用，從而從整體上表現為抗氧化效果大大增強。

4 結論

本研究結果表明，阿魏酸與抗壞血酸的復配溶液對自由基的清除率最大，其次是阿魏酸與蘆丁的復配溶液，最后是抗壞血酸與蘆丁的復配溶液。對3組分進行協同抗氧化能力分析，發現3者間存在顯著的協同抗氧化性，回歸分析表明，3組分中蘆丁對總抗氧化能力的貢獻率最大，抗壞血酸次之，阿魏酸最小。利用3種物質的抗氧化協同作用并不能完全的解釋麥苗較強的抗氧化活性，說明麥苗的抗氧化性受多種組分的影響，需要考察更多的組分，以了解其抗氧化特點。

［1］林宣賢，林升清，廖惠珍.麥苗的營養成份及安全性實驗［J］.中醫藥信息，1996，(4):47 －48

［2］喬文靜.麥苗的營養及制品研究［J］.中國食物與營養，2009，7:59 －61

［3］Kulkarni SD，Tilak J C，Acharya R，et al.Evaluation of the antioxidant activity of wheatgrass(Triticum aestivm L)as a function of growth under different conditions［J］.Phototherapy Research，2006，20(3):218 －227

［4］黃碧光，劉思衡.麥苗的營養保健價值及其開發利用［J］.食品研究與開發，2001，22(5):40－42

［5］王永輝，李培兵，金宏，等.小麥草營養成分分析［J］.營養學報，2011，33(3):327 －238

［6］施瑛，汪梅，徐娟，等.麥苗汁的營養成分及其抗氧化活性測定［J］.食品科學，2005，26(1):215－218

［7］盧靜瓊，石文平，靳利娥，等.天然抗氧化物抗氧化協同效應研究進展［J］.食品工程，2009，(4):11 －13

［8］郝曉麗.七種抗氧化劑單一抗氧化活性及其協同作用的研究［D］.青島:青島大學，2002

［9］王岳飛，李磊，謝爭珍，等.茶多酚西洋參抗氧化活性比較及協同增效作用研究［J］.中外醫療，2008，(29):68

［10］Jia Z S，Zhou B，Yang L，et al.Antioxidant synergism of tea polyphenols andα－tocopherol against free radical induced peroxidation of linoleic acid in solution［J］.Journal of the Chemical Society，Perkin Transactions 2，1998，(4):911 －916

［11］中國預防醫學科學院營養與食品衛生研究所.GB/T 5009.86—2003蔬菜、水果及其制品中總抗壞血酸的測定(熒光法和2，4－二硝基苯肼法)［S］.北京:中國標準出版社，2003

［12］鄧斌，蔣剛彪，黃紅英，等.分光光度法測定夏枯草中總黃酮的含量［J］.時珍國醫國藥，2008，19(7):1608－1609

［13］張志清，王瀟，姚艷艷，等.超聲波輔助堿醇提取HPLC法測定麥麩中阿魏酸含量［J］.中國糧油學報，2010(4):96－99

［14］郭文莉，李敏，謝瓊，等.葡萄皮色素抗氧化活性的初步研究［J］.中國食品添加劑，2007，(2):116 －119.

［15］Roberta R，Nicoletta P，Anna P，et al.Antioxidant activity applying an improved ABTSradical cation decolorization assay［J］.Free Radical Biology ＆ Medicine，1999，26(9):1231－1237

［16］Douglas C Montgomery.實驗設計與分析(第 6版)［M］.北京:人民郵電出版社，2009:134－156

［17］劉仁杰，盧丞文，郭志軍，等.不同生長期蕎麥苗中總黃酮含量的變化研究［J］.吉林農業科學，2007，32(6):58－60

［18］張志清，蒙昭，姚艷艷，等.小麥苗中阿魏酸含量變化分析［J］.食品科學，2010，31(18):271－274

［19］向建軍，姚艷艷，蒲至恩，等.小麥葉片中幾種抗氧化組分的含量變化研究［J］.中國糧油學報，2011，26(11):18－22

［20］陸云梅，黃華仁，夏仁學.紅肉臍橙果實中抗氧化物質含量及其抗氧化活性變化［J］.果樹學報，2011，28(1):134－137

［21］李書國，李雪梅，陳輝，等.油脂復合抗氧化劑抗氧化協同增效作用的研究［J］.糧油加工與食品機械，2004(4):42－44.