小麥胚芽水溶性提取物的體外抗乳腺癌活性研究

朱科學 連彩霞 郭曉娜 周惠明

(江南大學食品學院，無錫 214122)

小麥胚芽是小麥干法加工的主要副產物之一，含有豐富的蛋白質和油脂，并且含有多種生理活性成分，是不可多得的天然優質食品資源［1］。近年來，有較多的研究表明小麥胚芽具有抗氧化［2］、抗高血壓［3］、增強免疫力［4－5］和抗疲勞［6］等多種生理活性。然而近年來，隨著對小麥胚芽研究的深入，其提取物的抗腫瘤活性得到了越來越多研究者的關注［7－8］。開發以小麥胚芽提取物為抗腫瘤功效成分的健康食品，具有無毒安全營養的特點，對深度開發和綜合利用小麥胚芽資源具有較好的現實意義。本試驗通過體外細胞的方法，研究小麥胚芽水溶性提取物的對乳腺癌細胞(MDA－MB231)增殖活性、生長曲線和細胞形態的影響，為小麥胚芽水溶性提取物作為抗腫瘤食品配料提供理論和試驗依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

新鮮的小麥胚芽由淮安新豐面粉有限公司提供;MDA－MB231細胞:中國科學院上海生命科學研究院細胞資源;RPMI 1640培養基:美國GIBCO公司;青霉素、鏈霉素為醫用級;胰酶:華美生物工程有限公司;Hoechst 33242染色液:碧云天生物技術研究所;新生牛血清:杭州四季青生物工程材料有限公司;其他試劑均為分析純。

1.2 試驗儀器

DFY－600搖擺式高速中藥粉碎機:溫嶺市林大機械有限公司;RE－52A旋轉蒸發儀:上海亞榮生化儀器廠;UV－2800型紫外可見分光光度計:尤尼柯上海儀器制造公司;5804R高速冷凍離心機:德國艾本德公司;超低溫冷凍冰箱:美國INVETRO公司;Multiskan Mk3酶標儀:美國Thermo公司;倒置顯微鏡:OLYMPUS BX51;掃描電子顯微鏡:荷蘭FEI公司;96孔細胞培養板:美國Costar公司;CO2培養箱:Thermo Forma公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 脫脂麥胚粉及水溶性提取物的制備

除雜后的新鮮小麥胚芽加入正己烷浸泡脫脂，間隔2 h更換一次正己烷，直至滴在濾紙上的上清液風干后無油印為止。將脫脂后的麥胚風干后過篩(60目)除去附著的細粉，經搖擺式高速中藥粉碎機粉碎過篩(100目)得到細粉即為脫脂麥胚粉。

將脫脂麥胚粉和去離子水以液料比10:1混合;攪拌提取3 h，然后低溫離心(10 000 r/min，4℃，20 min)得到上清液，將殘渣再用去離子水提取1 h，相同條件下離心，將兩次得到的上清液進行冷凍干燥后即得水溶性提取物。

水溶性提取物的蛋白質含量測定采用微量凱氏定氮法測定(N×6.25);總糖含量采用苯酚硫酸法測定;總酚含量采用Folin－Ciocalteu試劑測定。

1.3.2 細胞培養

將人源乳腺癌細胞MDA－MB231細胞培養于含有10%小牛血清，100單位/mL青霉素和100單位/mL鏈霉素，以及2 mmol/L谷氨酸鹽的 RPMI1640完全培養基中，置于37℃，5%CO2培養箱中培養。MDA－MB231細胞在細胞瓶里呈單層生長，每3天以0.25%胰酶消化傳代一次，取對數生長期的細胞進行試驗［9］。

1.3.3 MTT法測定提取物抑制MDA－MB231細胞增殖活性

0.25%胰酶消化得到的對數生長期細胞，臺盼藍染色計數，用RPMI1640完全培養液調整細胞濃度為5×104個/mL，將100μL細胞加入96孔培養板中，置37℃，5%CO2培養箱中培養24 h，再加入含有提取物的RPMI1640完全培養基100μL，空白對照組為加入等體積的正常的RPMI1640完全培養基，每組濃度設6個復孔，將細胞培養板移入CO2培養箱中，在37℃，5%CO2及飽和濕度條件下培養24、48、72 h。

培養結束后，吸去培養液，每孔加入100μL MTT溶液(0.5 mg/mL)，繼續在37 ℃，5%CO2培養箱中培養4 h，徹底除去上清液，每孔加入150μL二甲亞砜(DMSO)，在37℃下培養20 min后，在570 nm處測定各孔的吸光度，每個試驗重復4次，計算抑制率［9］。

1.3.4 小麥胚芽水溶性提取物對細胞生長曲線的影響

采用MTT比色法計數測定［10］:取對數生長期的MDA－MB231細胞，經0.25%胰酶消化后，用 RPMI1640完全培養基調整細胞濃度1×107個/mL，將細胞濃度倍比稀釋至1×102個/mL，每個稀釋度六孔細胞，培養板置于37℃，5%CO2培養箱中培養4 h后細胞貼壁，吸走培養液，每孔中加入100μL MTT(0.5 mg/mL)繼續培養4 h，然后吸出上清液，加入150μL DMSO，37℃下保溫20 min，在570 nm處測定吸光度，根據吸光度和細胞濃度繪出標準曲線，每個試驗重復3次。

參照方法1.3.3，將得到的吸光度在標準曲線上計算出相應的細胞數，即可繪出細胞的生長曲線。

1.3.5 小麥胚芽水溶性提取物對MDA－MB231細胞的生長狀況影響

取對數生長期MDA－MB231細胞，用RPMI1640完全培養基調整細胞濃度至1×105個/mL，加入細胞培養瓶中。正常培養基培養24 h后，然后加入含有小麥胚芽水溶性提取物的RPMI1640完全培養基使培養基里提取物的最終濃度為750、1 000、1 500 μg/mL，在37℃，5%CO2及飽和濕度條件下培養24、48、72 h，在倒置顯微鏡下觀察細胞培養瓶中細胞的生長狀態［11］。

1.4 數據統計與分析

2 結果與分析

2.1 小麥胚芽水溶性提取物的提取及組成

原料是脫脂麥胚粉，其水溶性提取物的提取率達到48.03%。水溶性提取物中蛋白質質量分數為38.47%，總糖含量為 48.11%，總酚含量為14.63 mgGAE/g。

2.2 小麥胚芽水溶性提取物對乳腺癌(MDAMB231)細胞生長增殖抑制率

MTT法是目前美國國立腫瘤所推行的抗癌藥物體外篩選的有效方法，該法測定活細胞數目及細胞增殖能力，操作簡單，試驗周期短，所需細胞數少，而且無放射性污染，其檢測結果與同位素滲入法有良好的一致性，適用于體外大規模篩選。MTT的四氮唑環在線粒體脫氫酶作用下生成藍紫色的甲臜，甲臜在最大吸收波長570 nm處吸光度值與其形成量有關。只有活細胞內才形成甲臜，死細胞無此功能，所以570 nm處吸光度值與活細胞數成正比，以此鑒別活死細胞。

從圖1可以看出，小麥胚芽水溶性提取物對MDA－MB231細胞增殖有顯著抑制作用，并且呈現劑量效應。提取物濃度為1 500μg/mL時，水溶性提取物作用48和72 h后的抑制率分別達到80.84%和90.05%。小麥胚芽水溶性提取物作用24、48和72 h后其IC50值分別為1 751、721和650μg/mL，說明小麥胚芽水溶性提取物對MDA－MB231細胞增殖具有明顯的抑制作用，呈現一定的劑量效應，并且隨著提取物對MDA－MB231細胞作用時間的延長，提取物的抑制率均有所上升。

圖1 小麥胚芽水溶性提取物對MDA－MB231細胞增殖抑制作用

2.3 小麥胚芽水溶性提取物對MDA－MB231生長曲線的影響

細胞生長曲線是測定細胞絕對生長數的常用方法，是培養細胞生物學特性的基本參數之一。消化傳代后的細胞經過短暫的懸浮然后貼壁，渡過一定時間的潛伏期，隨即進入大量分裂的指數生長期。在細胞達到飽和密度后，停止生長，進入平頂期，進而退化衰亡。

圖2 小麥胚芽水溶性提取物對MDA－MB231細胞生長曲線的影響

生長曲線體現了MDA－MB231細胞在體外培養過程中的增殖動態變化。從圖2中可以清楚地看出小麥胚芽水溶性提取物對MDA－MB231細胞生長曲線的影響?？瞻捉M細胞貼壁后生長迅速，細胞數隨時間延長顯著上升，添加500和750μg/mL小麥胚芽水溶性提取物的MDA－MB231細胞生長相對緩慢，細胞數上升緩慢。1 000和1 500μg/mL水溶性提取物作用的MDA－MB231細胞出現負增殖。隨著提取物濃度的增加和培養時間的延長，MDAMB231增殖降低，甚至出現負增殖，呈現了一定的劑量效應和時間效應。

2.4 小麥胚芽水溶性提取物對MDA－MB231細胞形態影響

細胞的形狀多種多樣，有球體、多面體、紡錘體和柱狀體等。細胞內在的結構、自身表面張力以及外部的機械壓力不同，各種細胞總是保持自己的一定形狀。當細胞所處的環境發生改變時，細胞受到影響，細胞形態也會發生不同程度的變化。在顯微鏡下觀察細胞形態的變化也可以推斷細胞生長的狀況是否良好。

圖3 小麥胚芽水溶性提取物對MDA－MB231細胞作用24 h后細胞形態的影響(×100)

從圖3中可以看出，空白組正常的 MDAMB231細胞成纖維狀，大小均勻，表面光滑折光性好，細胞貼壁生長正常，而小麥胚芽水溶性提取物作用后的MDA－MB231細胞細胞數有所減少，提取物抑制了MDA－MB231細胞的生長和增殖，并呈現一定的劑量效應。隨著提取物濃度的增大，細胞的特征形態逐漸消失，細胞數越來越少，纖維變短，部分細胞開始簇集成團。

從圖4中可以看出，正常組細胞飽滿，表面光滑，折光性好，而小麥胚芽水溶性提取物作用48h的細胞細胞數量明顯減少，形態變化較大，細胞皺縮變小，與周圍的細胞脫離，大量細胞簇集成團，培養液里漂浮死細胞。

圖4 脫脂麥胚水提物對MDA－MB231細胞作用48 h后細胞形態的影響(×100)

圖5 脫脂麥胚水提物對MDA－MB231細胞作用72 h后細胞形態的影響(×100)

從圖5中可以看出，空白組正常細胞成纖維狀，細胞貼壁生長排列緊密，相互連接粘附。小麥胚芽水溶性提取物作用72 h MDA－MB231細胞，細胞貼壁異常，纖維狀特征逐漸消失，細胞變圓，細胞大小差異增大，大量細胞死亡脫落，漂浮在培養液中。高濃度的提取物作用細胞細胞數很少，細胞完全沒有細胞特征形態。

不同濃度的小麥胚芽水溶性提取物作用細胞24、48和72 h后，將培養瓶置于倒置顯微鏡下觀察到細胞形態顯示:提取物對細胞的細胞數和細胞形態都有所影響，提取物作用后的細胞數目變少，細胞形態明顯變化，培養液里漂浮有死細胞，小麥胚芽水溶性提取物對MDA－MB231細胞的生長增殖有很好的抑制作用。

3 結論

小麥胚芽水溶性提取物對乳腺癌細胞(MDAMB231)生長增殖有顯著的抑制活性，并且抑制效果呈現一定的時間效應和劑量效應。提取物作用后的細胞，細胞呈現凋亡的明顯特征:細胞數明顯變少，細胞開始簇集成團，貼壁異常，細胞纖維狀特征形態逐漸消失，個體變圓，折光率降低，培養液里漂浮死細胞。在后續的研究中我們將對其中的功效因子進行分析鑒定，并對其作用機理進行深入探討。

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