益生菌發酵豆乳中營養成分變化研究

吳 瓊 于寒松，2 張 嵐 劉俊梅，2 王玉華，2 常 鑫 胡耀輝，2

(吉林農業大學食品科學與工程學院1，長春 130118)

(國家大豆產業技術研發中心加工研究室2，長春 130118)

(吉林醫藥學院3，吉林 132000)

豆乳是人類重要的植物蛋白資源，富含優質蛋白［1］。由于大豆蛋白的氨基酸譜與人類的需求密切相關，因此它比任何一種植物蛋白對人體都有益［2］。益生菌是指投入后通過改善宿主腸道菌群生態平衡而發揮有益作用，達到提高宿主(人和動物)健康水平和健康佳態的活菌制劑及其代謝產物。目前，最常見的益生菌基本都屬于乳酸菌和兩歧雙岐桿菌菌屬［3－4］。

由于植物乳桿菌產生蛋白酶、有機酸等物質，不僅可將大豆中蛋白質、膳食纖維、低聚糖等大分子物質分解成小分子，將一些不溶性大分子化合物分解成可溶性小分子化合物，實現所謂的預消化作用，從而有利于促進蛋白質的消化吸收，而且使鈣轉化成乳酸鈣，成為可溶性鹽，從而大大的提高了鈣的吸收率［5－7］。兩歧雙岐桿菌是人體內主要的雙岐桿菌之一［8］，是自然棲居在人體腸道中的有益菌株，其主要作用有抑制有害菌群、維持腸道菌群平衡和保護腸道;代謝中產生有機酸、促進腸道蠕動、腹瀉便秘雙重調節［9］。因此，利用益生菌發酵豆乳可顯著增加大豆制品的營養價值。

目前，未見針對植物乳桿菌和兩歧雙岐桿菌混合菌種發酵豆乳的報道，本試驗將對植物乳桿菌、雙岐桿菌、混合菌種發酵前后豆乳營養成分變化進行比較分析，以期為發酵豆乳研究奠定良好的試驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

大豆:市售。兩歧雙岐桿菌、植物乳桿菌:本研究室自用保藏菌種。

硫酸、硼酸、鹽酸、甲基紅、硫酸銅、溴甲酚綠、碳酸氫鈉、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀等。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器

SW－CJ－1F超凈工作臺:蘇州安泰空氣技術有限公司;DHP120恒溫培養箱:上海實驗儀器廠有限公司;LDZX－50KBS立式電熱壓力蒸氣鍋:上海申安醫療器械廠;infinitieM200酶標儀:NanoQuant;TL－18M高速臺式離心機:上海離心機研究所;UV－2600型紫外可見分光光度計:尤尼柯(上海)有限公司;L－8800氨基酸自動分析儀:日本日立。

1.3 方法

1.3.1 豆乳的制作工藝

挑選大豆→脫皮→浸泡→磨漿→膠體磨→帶渣煮漿→過濾→分裝→滅菌→冷卻→成品

1.3.2 發酵豆乳的制備

按1.3.1制作豆乳，其中分別接入植物乳桿菌、兩歧雙岐桿菌和混合菌種。接種量均為10%，混合菌種比例為植物乳桿菌∶兩歧雙岐桿菌 =1∶1，于37℃發酵。發酵后將豆乳在－45℃條件下真空冷凍干燥，待用。

1.3.3 發酵豆乳中蛋白質含量的測定

凱氏定氮法［10］。

1.3.4 發酵豆乳中蛋白質分子量的測定

SDS－PAGE凝膠電泳。濃縮膠濃度為4%，分離膠濃度為 12%［11］。

1.3.5 發酵豆乳中小肽含量的測定

75%乙醇沉降法［12］。

1.3.6 發酵豆乳中氨基酸含量的測定

采用氨基酸自動分析儀［13］。

1.4 數據處理

平均值和標準差由3個樣品的測量結果經計算得到，數據處理與分析采用SPSS 12.0軟件進行方差分析，并且應用Excel進行常規數據處理。。

2 結果與分析

2.1 發酵豆乳可溶性蛋白質含量比較

采用兩歧雙岐桿菌和植物乳桿菌對豆乳進行單菌種和復合菌種發酵后，樣品中蛋白質含量如圖1。

圖1 發酵豆乳蛋白質含量變化

植物乳桿菌、雙岐桿菌7～12 h為菌種生長對數期，因此單菌種發酵采用7～12 h進行測定，混合菌種在5～12 h菌體活力最強，因此選擇5～12 h進行測定。由圖1可知在發酵過程中豆乳本身氮元素含量沒有發生變化，因此單菌種和混合菌種發酵時蛋白質含量隨著發酵時間的延長，基本沒有變化。但接入菌種后由于菌體中含有蛋白質，導致豆乳中引入了新的氮元素，因此，在接入菌種初期豆乳蛋白質含量增加，之后保持平穩狀態。

2.2 發酵豆乳蛋白質分子質量分布比較

發酵豆乳中蛋白質分子質量分布分析結果見圖2～圖4。

由圖2～圖4蛋白質電泳圖譜可見，未發酵的豆乳蛋白有8條蛋白條帶，分子質量分別為200、80、70、40、35、30、20、14 ku;植物乳桿菌與兩歧雙岐桿菌混合發酵12 h后，豆乳中僅剩5條蛋白條帶，分子質量分別為 35、30、20、14、6.5 ku。由于在發酵過程中產生一系列蛋白酶，將大分子蛋白降解為小分子蛋白，與未發酵豆乳比較，分子質量為200和80 ku的蛋白質明顯降解，在12 h之后幾乎消失，由于大分子蛋白的降解，蛋白分子質量35 ku左右的條帶加粗，表明35 ku分子質量蛋白質有所增加，且小分子質量條帶表達稍有增加;兩歧雙岐桿菌與混合菌種發酵豆乳變化趨勢基本相似，發酵12 h后有6條蛋白條帶，蛋白質分子質量分別為 35、30、25、23、20、15 ku，由于兩歧雙岐桿菌發酵也產生一定量的蛋白酶，因此，小分子質量的蛋白條帶有所增加。植物乳桿菌發酵豆乳12 h后，有5條蛋白條帶，蛋白分子質量分別為35、30、25、20、15 ku。蛋白分子質量為 200 和80 ku左右的條帶經發酵后明顯降解，35 ku左右的條帶出現微弱的降解，且小分子質量條帶稍有增加。由此可以推測，發酵后大分子蛋白經蛋白酶降解為小分子蛋白。

2.3 發酵豆乳小肽含量比較

采用兩歧雙岐桿菌和植物乳桿菌進行單菌種和復合菌種制備發酵豆乳中小肽分析結果見圖5。

圖5 發酵豆乳小肽含量變化

由圖5可知，植物乳桿菌、兩歧雙岐桿菌和混合菌種發酵豆乳過程中小肽含量隨著發酵時間延長逐漸增加，小肽含量最高出現在10 h，小肽含量分別比未發酵豆漿增加了19.4%、22.16%和27.12%，通過SPSS 12.0軟件分析后，混合菌種、植物乳桿菌和兩歧雙岐桿菌發酵豆乳發酵中小肽含量最大值與未發酵豆乳中小肽含量均差異極顯著(P＜0.000);混合菌種發酵豆乳分別與植物乳桿菌和雙岐桿菌發酵豆乳進行比較，小肽含量最大值與兩者均差異極顯著(P＜0.000)，植物乳桿菌和雙岐桿菌發酵豆乳比較，兩者小肽含量最大值差異不顯著(P＞0.1)。

2.4 兩歧雙岐桿菌和植物乳桿菌單菌種發酵與混合發酵豆乳氨基酸含量比較

采用兩歧雙岐桿菌和植物乳桿菌對豆乳進行單菌種和復合菌種發酵后，分析樣品中天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、組氨酸、精氨酸、脯氨酸等16種氨基酸，其中變化明顯的氨基酸結果見表1～表3。

由表1～表3可知，植物乳桿菌發酵豆乳時間為10 h時總氨基酸含量達到最高，與未發酵豆乳相比增加了8.22%。兩歧雙岐桿菌發酵豆乳時間為7 h時總氨基酸含量達到最高，與未發酵豆乳相比增加了10.61%。混合菌種發酵時間為12 h時總氨基酸含量達到最高。由于混合菌種發酵前期消耗的氨基酸較多，因此氨基酸含量有所偏低，當發酵時間12 h時氨基酸含量達到最高。與未發酵豆乳相比增加了9.95%。

表1 植物乳酸發酵豆乳氨基酸變化/%

表2 雙岐桿菌發酵豆乳氨基酸變化/%

表3 混合菌種發酵豆乳氨基酸的變化/%

3 討論與結論

本研究菌種選取植物乳桿菌和兩歧雙岐桿菌作為發酵的菌株，由于兩歧雙岐桿菌可以抑制蠟樣芽孢桿菌等腐敗菌繁殖［14］，植物乳桿菌可以產生共軛亞油酸、低聚糖、蛋白酶、有機酸等有益人體生命活動的物質［15］，因此將兩種菌株進行混合發酵豆乳，并且兩者混合后可保證在4 h達到凝乳。本研究從蛋白質的含量、分子質量、小肽、氨基酸方面比較了植物乳桿菌、兩歧雙岐桿菌單菌種發酵和混合菌種發酵豆乳的變化。由于植物乳桿菌、雙岐桿菌7～12 h為菌種生長對數期，因此單菌種發酵采用7～12 h進行測定，混合菌種在5～12 h菌體活力最強，因此選擇5～12 h進行測定。

由于接入菌種后菌體中含有蛋白，導致豆乳在植物乳桿菌、兩歧雙岐桿菌、混合菌種發酵過程中蛋白質含量增加，隨后蛋白質含量基本保持恒定。

未發酵豆乳蛋白有8條蛋白條帶，由于在發酵過程中產生一定量的蛋白酶，這些蛋白酶將大分子蛋白質分解成小分子蛋白質，因此混合菌種發酵豆乳12 h后有5條蛋白條帶，未發酵豆乳中分子質量為200和80 ku蛋白質經過發酵后明顯降解，在12 h之后幾乎消失;蛋白分子質量35 ku左右的條帶出現加粗趨勢，且小分子質量條帶表達稍有增加。雙岐桿菌與混合菌種發酵豆乳變化基本相似，發酵12 h后有6條蛋白條帶，植物乳桿菌發酵豆乳12 h后，有5條蛋白條帶。研究表明豆乳中呈現豆腥味的脂肪氧化酶分子質量為80 ku［16］，由于本文采用植物乳酸菌、兩歧雙岐桿菌單菌種和混合菌種發酵豆乳中蛋白分子質量為200和80 ku左右的條帶經發酵后明顯降解，因此豆腥味明顯下降。這為益生菌發酵有助于減弱豆腥味的形成，改善發酵制品的風味提供了理論依據。此結果與楊媚［16］采用保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌發酵豆乳蛋白質分子質量80 ku左右條帶明顯降解，小分子質量條帶表達稍有增加的結果相符，而本試驗采用的雙岐桿菌和植物乳桿菌發酵后大分子條帶基本全部降解，說明降解蛋白質能力較高，發酵后的豆乳大分子蛋白變為小分子蛋白更易被人體吸收。

在植物乳桿菌、兩歧雙岐桿菌、混合菌發酵豆乳產生的蛋白酶作用下將蛋白質分解成小肽，使得小肽含量分別增加了19.4%、22.16%和27.12%。

發酵豆乳的氨基酸在種類上并沒有增加，但是在含量上都有不同程度的變化，氨基酸總含量分別增加了9.95%、8.22%和 10.61%。與 Song 等［17］用雙岐桿菌Bb12、酵母菌IFJ87發酵大豆粉中氨基酸總含量分別增加了0.74%、9.06%相比，本試驗中植物乳桿菌和兩歧雙岐桿菌混合發酵后氨基酸總含量略高，各種氨基酸含量均不同程度增加。特別是纈氨酸、亮氨酸、賴氨酸分別增加了8.02%、10.85%、8.15%。以上結果表明，益生菌發酵之后對豆乳大分子蛋白質起到了預消化作用，同時有效降低了豆乳的豆腥味，改善了豆乳的風味。

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