文冠果殼黃酮提取物抑制酪氨酸酶活性的研究

張洪梅 耿 杰 周泉城

(山東理工大學(xué)農(nóng)業(yè)工程與食品科學(xué)學(xué)院，淄博 255049)

文冠果是我國(guó)特有的優(yōu)良珍貴木本油料作物，在生物柴油開(kāi)發(fā)、水土保持、新木材培植以及植物觀賞領(lǐng)域等各方面，都有極大的開(kāi)發(fā)價(jià)值［1］。近年來(lái)，由于其較高的工業(yè)、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，越來(lái)越受到人們的關(guān)注。如今我國(guó)種有大量的文冠木，種仁多用于制取生物柴油，而果殼作為廢棄物未曾得到合理的利用。研究表明，文冠果果殼中含有脂肪酸、皂苷、甾醇、黃酮等多種化學(xué)成分。

黃酮是以苯色酮環(huán)為基礎(chǔ)的酚類(lèi)化合物。多為晶體型固體或無(wú)定形粉末，顏色與結(jié)構(gòu)有一定的關(guān)系，一般呈黃色。在自然界中一般以苷類(lèi)形式存在，并且由于結(jié)合糖的種類(lèi)、數(shù)量、位置及聯(lián)接方式的不同，可以形成各種各樣黃酮苷類(lèi)［2］。黃酮類(lèi)化合物已經(jīng)引起了人們的廣泛重視，因?yàn)樗鼛缀醮嬖谟谒芯G色植物中，是許多中草藥的有效成分［3］。研究表明黃酮類(lèi)物質(zhì)有抗氧化和清除自由基的作用;保護(hù)心腦血管系統(tǒng)、抗衰老、抗腫瘤、抗癌作用;調(diào)節(jié)免疫能力以及降血糖降血脂等諸多生理功能［4］。黃酮類(lèi)化合物的功能已經(jīng)被人們認(rèn)可，因此黃酮類(lèi)化合物也已經(jīng)廣泛應(yīng)用。

酪氨酸酶(Tyrosinase)是一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的多亞基的含銅氧化還原酶［5］，廣泛存在于人體、動(dòng)植物及微生物中［6－9］。來(lái)源于胚胎神經(jīng)峭細(xì)胞，是黑色素代謝和兒茶酚胺的關(guān)鍵酶。酪氨酸酶活性越高，黑色素生成越多;活性被抑制，產(chǎn)生黑色素的能力就相應(yīng)降低。因此，顏色較深的皮膚中的酪氨酸酶活性要更高一些。要想控制皮膚黑化，可以想辦法抑制酪氨酸酶的活性。酪氨酸酶突變可中斷銅結(jié)合使其催化活性喪失，眼、皮膚白化病是由于酪氨酸酶基因突變所致，而酪氨酸過(guò)量異常表達(dá)可導(dǎo)致色素沉積性疾病。酪氨酸酶抑制劑可以用于治療雀斑、黃褐斑、老年斑等常見(jiàn)的色素沉積導(dǎo)致的皮膚病［10］。目前，市場(chǎng)上流行的美白化妝品中增白劑大多是酪氨酸酶抑制劑如熊果苷、維生素C衍生物及一些中藥提取物等［11］。

本試驗(yàn)旨在確定適合提取文冠果殼中黃酮的溶劑，并對(duì)文冠果黃酮對(duì)酪氨酸酶的抑制作用進(jìn)行研究，以期為文冠果殼的合理開(kāi)發(fā)利用提供思路和依據(jù)，增加文冠果的附加值、提高資源綜合利用效率。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

文冠果:陜西金道種業(yè)有限公司;酪氨酸酶(≥30 U/mg):合肥博美生物科技有限公司，酶溶液以pH 6.8磷酸緩沖液配成適宜濃度。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)設(shè)備

101A22E電熱鼓風(fēng)干燥箱:上海實(shí)驗(yàn)儀器廠;FZ102植物粉碎機(jī):天津泰斯特儀器公司;SHB－111循環(huán)水式真空泵:鄭州金育科貿(mào)有限公司;RE 52－86E旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器:上海亞榮生化儀器廠;TDL－40B離心機(jī):上海安亭科學(xué)儀器廠;XW－80A旋渦混合器上海青浦滬西儀器廠;UV－2102紫外－可見(jiàn)分析儀:尤尼柯儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 文冠果殼黃酮提取

1.3.1.1 乙醇浸提流程

文冠果殼→粉碎→石油醚脫脂→乙醇浸提→過(guò)濾→濾液濃縮。

取文冠果殼于烘箱中干燥至恒重，粉碎得粉末，稱取粉末20 g，置于200 mL燒瓶中，60～90℃石油醚脫脂3次，時(shí)間4 h，液料比5∶1。加入70%的乙醇溶液70℃冷凝回流5 h，液料比7∶1。濾去殘?jiān)?，回收乙醇?0%，在濃縮液中加入3倍體積的無(wú)水乙醇，攪拌均勻，置于4℃冰箱內(nèi)靜置24 h，進(jìn)行醇沉以除去蛋白質(zhì)、多糖、樹(shù)脂等雜質(zhì)。過(guò)濾，除去沉淀物，繼續(xù)回收溶劑得浸膏。浸膏用8倍水量溶解，3 500 r/min離心分離15 min，取上清液作為試驗(yàn)樣品。

1.3.1.2 水浸提流程

文冠果殼→粉碎→石油醚脫脂→水浸提→過(guò)濾→濾液濃縮。

取文冠果殼于烘箱中干燥至恒重，粉碎得粉末，稱取粉末20 g，置于200 mL燒瓶中，60～90℃石油醚脫脂3次，時(shí)間4 h，液料比5∶1。加入去離子水(pH值為 10.5～11.5)140 mL，于 90 ℃冷凝回流120 min。濾去殘?jiān)?，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，3 500 r/min離心分離15 min，上清液作為試驗(yàn)樣品。

1.3.2 樣品中黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定

1.3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線［12］

配制0.1 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)液0.20、0.60、1.00、1.40 mL，分別置于 10 mL 比色管中，加入0.3 mL，5%的亞硝酸鈉，在旋渦混合器上搖勻，靜置5 min，然后加入0.3 mL，10%的硝酸鋁，震蕩搖勻，靜置5 min，最后加入4%的氫氧化鈉2.5 mL，搖勻靜置15 min后定容至刻線?？瞻兹芤簽閰⒈热芤?，在510 nm處測(cè)定吸光度值。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(c)對(duì)吸光度(A)作回歸處理，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

1.3.2.2 黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)算

文冠果殼醇提取液中的黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)按NaNO2－A1(NO3)3比色法顯色法測(cè)定［13］。吸取文冠果殼黃酮提取液1 mL于試管中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法操作，測(cè)定反應(yīng)液吸光度。做3個(gè)平行試驗(yàn)，取平均值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求出提取液中黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

計(jì)算方法:

回歸方程:Y=0.001 8X+0.003 9，R2=0.996 8

質(zhì)量分?jǐn)?shù) =NV(Y－0.003 9)/(0.001 8 ×106m)×100%

式中:N為稀釋倍數(shù);V為溶液體積/mL;m為原料重量/g。

1.3.3 抑制酪氨酸酶活性試驗(yàn)

1.3.3.1 酪氨酸酶活性測(cè)定方法及抑制率計(jì)算

［14］操作:酪氨酸酶活力以催化L－多巴氧化反應(yīng)生成多巴醌的二酚酶活力來(lái)衡量。試管中加入 L － 多巴 0.4 mL(1.0 mg/mL)，pH 6.8 磷酸緩沖液2.4 mL，30℃水浴保溫10 min后，加入酪氨酸酶0.2 mL(250 U/mL)混和均勻，酶促反應(yīng)將L－多巴轉(zhuǎn)化為紅色產(chǎn)物多巴醌，在475 nm處有最大吸收。以每分鐘A475增加0.001為1個(gè)酶活力單位，酶促反應(yīng)的速度用每分鐘A475增加值來(lái)表示。從混合均勻開(kāi)始測(cè)量，每30秒測(cè)定一次，測(cè)到7 min。按如下兩式計(jì)算相對(duì)酶活力和酶抑制率。

式中:A1為無(wú)黃酮提取液有底物時(shí)的吸光度;A2為無(wú)黃酮提取液無(wú)底物時(shí)的吸光度;A3為有黃酮提取液與底物時(shí)的吸光度;A4為有黃酮提取液無(wú)底物時(shí)的吸光度。

1.3.3.2 不同濃度文冠果黃酮對(duì)酪氨酸酶活力的影響

按1.3.3.1 方法，在試管中加入底物溶液 0.4 mL，以及不同量的文冠果黃酮，pH 6.8磷酸緩沖液補(bǔ)充反應(yīng)液至2.8 mL，30℃水浴保溫10 min，加入酪氨酸酶0.2 mL(250 U/mL)混和均勻后立即測(cè)定各反應(yīng)的吸光度變化，計(jì)算抑制率。

1.3.3.3 不同反應(yīng)順序?qū)σ种谱饔玫挠绊?/p>

其他條件相同，底物、文冠果黃酮和酪氨酸酶按以下3種順序加入:(A)底物與酪氨酸酶反應(yīng)10 min后加入文冠果黃酮;(B)文冠果黃酮與酪氨酸酶預(yù)熱10 min后加入底物進(jìn)行反應(yīng);(C)底物與文冠果黃酮預(yù)熱10 min后加入酪氨酸酶進(jìn)行反應(yīng)。測(cè)定各反應(yīng)吸光度變化，計(jì)算抑制率。

1.3.3.4 不同反應(yīng)時(shí)間下對(duì)抑制作用的影響

取定量的底物溶液與定量黃酮提取液于30℃水浴保溫10 min，加入定量的酪氨酸酶反應(yīng)不同時(shí)間，測(cè)定有無(wú)提取液加入情況下反應(yīng)液的吸光度變化，計(jì)算抑制率。

1.3.3.5 文冠果黃酮對(duì)酪氨酸酶的抑制作用類(lèi)型

其他條件相同，在反應(yīng)體系加入定量酪氨酸酶，給定文冠果黃酮濃度，測(cè)定底物濃度不同時(shí)酶促反應(yīng)的吸光度值，求出相應(yīng)的反應(yīng)速度。按Lineweaver－Burk的雙倒數(shù)作圖法作圖，確定抑制作用的類(lèi)型，得出米氏常數(shù)Km、最大反應(yīng)速度Vmax。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按1.3.2.1方法操作，測(cè)得各濃度下的吸光度。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品濃度(c)對(duì)吸光度(A)作回歸處理。繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖1。得回歸方程:Y=0.001 8X+0.003 9，R2=0.996 8。

圖1 黃酮測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 文冠果黃酮的提取溶劑確定

由表1可知，醇提取法測(cè)得黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.15%左右而水提取法質(zhì)量分?jǐn)?shù)在1.82%左右。乙醇提取液黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，表明乙醇作為提取劑更加合適。因此選用文冠果殼醇提取液作為抑制劑測(cè)定文冠果黃酮對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用。

表1 文冠果殼黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)

2.3 抑制酪氨酸酶活性試驗(yàn)

2.3.1 酪氨酸酶催化L－多巴氧化反應(yīng)

L－多巴在酪氨酸酶作用下轉(zhuǎn)化為紅色產(chǎn)物多巴醌，反應(yīng)體系中顏色的深淺與生成物濃度成正比。由圖2反應(yīng)液吸光度隨反應(yīng)時(shí)間的變化可知，反應(yīng)體系的吸光度隨反應(yīng)時(shí)間的增加而增大，即多巴醌的濃度不斷增加。但曲線斜率的逐漸減小，意味著反應(yīng)速度降低。7 min時(shí)，反應(yīng)速度為零，因此選擇測(cè)定時(shí)間為0～7 min。

圖2 酪氨酸酶催化L－多巴氧化反應(yīng)進(jìn)程曲線

2.3.2 不同濃度文冠果黃酮對(duì)酪氨酸酶活力的影響

由圖3黃酮對(duì)酪氨酸酶活性的抑制率可知，文冠果黃酮對(duì)酪氨酸酶有抑制作用，反應(yīng)時(shí)間相同時(shí)，抑制率隨黃酮濃度增大而增加。但并非呈線性變化。文冠果黃酮對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用隨時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。質(zhì)量濃度為0.48 mg/mL的黃酮提取液作用于酪氨酸酶，反應(yīng)時(shí)間為1 min時(shí)抑制率為39.3%，反應(yīng)時(shí)間為7 min時(shí)，抑制率為25.3%。

圖3 文冠果黃酮對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用

2.3.3 不同反應(yīng)順序?qū)σ种谱饔玫挠绊?/p>

底物、黃酮提取液和酪氨酸酶酶按1.3.3.3所述順序加入。測(cè)定各反應(yīng)吸光度變化，計(jì)算抑制率。得出不同反應(yīng)順序?qū)野彼崦富钚砸种谱饔玫挠绊懸?jiàn)圖4。

圖4 反應(yīng)順序?qū)野彼崦富钚砸种谱饔玫挠绊?/p>

由圖4可以看出，反應(yīng)順序的不同，作用效果差異明顯。在不同反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，操作B(文冠果黃酮提取液與酪氨酸酶預(yù)熱10 min后加入底物進(jìn)行反應(yīng))的抑制效果都明顯高于A(底物與酪氨酸酶反應(yīng)10 min后加入文冠果黃酮提取液)、C(底物與文冠果黃酮提取液預(yù)熱10 min后加入酪氨酸酶進(jìn)行反應(yīng))。說(shuō)明在酪氨酸酶催化L－多巴的反應(yīng)中，文冠果黃酮通過(guò)與酶相互作用，影響底物與酶反應(yīng)，從而達(dá)到抑制酶活的效果。

2.3.4 不同反應(yīng)時(shí)間文冠果黃酮對(duì)酪氨酸酶抑制作用的影響

定量的底物溶液、黃酮提取液與酪氨酸酶反應(yīng)不同的時(shí)間，測(cè)定有無(wú)黃酮提取液加入情況下反應(yīng)液的吸光度變化，得出不同反應(yīng)時(shí)間時(shí)文冠果黃酮對(duì)酪氨酸酶抑制率的變化見(jiàn)圖5。

圖5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)酪氨酸酶活性抑制作用的影響

由圖5可以得知:不同濃度的黃酮提取液對(duì)酪氨酸酶活性抑制作用的變化趨勢(shì)一致，反應(yīng)初始時(shí)抑制率最高，隨時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低。最高抑制率45.1%，由黃酮質(zhì)量濃度為0.48 mg/mL時(shí)反應(yīng)初始測(cè)得，當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行到7 min時(shí)，抑制率降到25.3%。

2.3.5 文冠果黃酮對(duì)酪氨酸酶抑制作用類(lèi)型

在文冠果黃酮濃度及酪氨酸酶一定的情況下，測(cè)定不同底物濃度時(shí)反應(yīng)體系吸光度的變化，求出相應(yīng)反應(yīng)速率，作反應(yīng)速率隨底物濃度變化圖，結(jié)果如圖6所示。

用底物濃度的倒數(shù)和反應(yīng)速率的倒數(shù)做Lineweaver－Burk圖，見(jiàn)圖7。

從圖7可以得知:未加文冠果黃酮提取液的試驗(yàn)組動(dòng)力學(xué)參數(shù) Km=1.05 mg/mL，Vmax=0.119 ΔA/min。加入提取液的試驗(yàn)組動(dòng)力學(xué)參數(shù) Km=1.23 mg/mL，Vmax=0.116 ΔA/min。2 條直線相交于第二象限并非交于橫軸上，加提取液組Km減增大，說(shuō)明文冠果黃酮提取液對(duì)酪氨酸酶的抑制作用類(lèi)型不是單純的非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。加入文冠果黃酮組最大反應(yīng)速度減小，競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用最大反應(yīng)速度應(yīng)不變，表明也不是單純的競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用。由于文冠果黃酮僅采用乙醇浸提未進(jìn)行純化，提取液中可能含有其他成分，因此不排除同時(shí)含有競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑和非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑多種有效成分，抑制機(jī)理有待于進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

3.1 醇提取法測(cè)得文冠果黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.15%左右，水提取法質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.82%左右。經(jīng)比較得知乙醇提取法測(cè)得文冠果殼中黃酮物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)更高。從資源利用率上來(lái)講，乙醇提取法比水取提法好。

3.2 本研究發(fā)現(xiàn)，文冠果黃酮對(duì)酪氨酸酶的活性存在抑制作用，且隨濃度的增加抑制劑對(duì)酶活性的抑制作用顯著增強(qiáng)，當(dāng)黃酮質(zhì)量濃度為0.48 mg/mL時(shí)，抑制率最高可達(dá)45.1%。因此，文冠果黃酮具有美白作用。此研究既實(shí)現(xiàn)了果殼廢物利用，也符合當(dāng)前以天然物質(zhì)為美容成分的發(fā)展趨勢(shì)，提高了農(nóng)產(chǎn)品的利用率和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

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