電針對帕金森病模型大鼠黑質細胞線粒體復合物活性的影響

王彥春 王培峻 馬 駿 許永海 梁少榮 何 方 周 丹 (湖北中醫藥大學，湖北 武漢 430061)

帕金林病(PD)的病因和發病機制迄今仍未徹底明確。針對線粒體功能改變的研究，對闡明PD的發病機制及指導臨床治療具有重要的意義。臨床針對PD的治療主要用多巴類藥物以補充腦內DA的含量，改善患者癥狀，但不能抑制疾病的發展且具有明顯的副作用。而針灸療法能提高L-D A類藥物療效，降低藥物劑量和減少并發癥，有效減緩PD發展，是一種安全的自然療法〔1，2〕，但機制不明。本實驗通過觀察電針對 PD模型大鼠的黑質酪氨酸羥化酶(TH)陽性神經元數目及線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ～Ⅳ活性的影響，初步探討電針治療PD。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 魚藤酮(Rotenone)及葵花油乳化液(Sunflower oil)購于Sigma公司，水合氯醛、多聚甲醛、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉均為國產分析純，即用型SABC免疫組化染色試劑盒，考馬斯亮藍蛋白定量試劑盒，線粒體分離試劑盒、線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ～Ⅳ活性比色法定量檢測試劑盒購于GENMED公司。G6805電針治療儀，低溫超速離心機，752紫外可見分光光度計等。

1.2 實驗動物 清潔級 SD大鼠48只，雄性，體重180～220 g，購于華中科技大學同濟醫學院實驗中心，許可證號:SCXK(鄂)2004-0007。經過三次行為測試確認無自發行為異常后隨機分為4組:①正常組;②溶劑對照組;③模型組;④電針治療組。正常組不做任何處理，假手術組只注射不含魚藤酮的等量葵花油乳化液，余下2組先造模，再作相應處理。

1.3 PD大鼠模型制備 將魚藤酮溶解于葵花油乳化液中，濃度為2 mg/ml，棕色試劑瓶保存。取大鼠稱重，采用頸背部皮下注射魚藤酮法制備模型，注射劑量為2 mg·kg-1·d-1。每天注射一次，連續注射28 d，制備PD大鼠模型。通過觀察大鼠的行為學改變及免疫組織化學技術檢測中腦黑質神經元數目以確定PD模型造模成功。

1.4 電針治療 電針治療組大鼠自造模7 d后開始電針治療，參照華興邦《實驗動物穴位圖譜》〔3〕取風府、太沖(太沖穴隔天左右交替使用)，用0.5寸毫針針刺，接G6805電針治療儀，連續波，頻率2 Hz，每次治療30 min，每天1次，治療21 d。

1.5 行為學觀察 自造模開始后，每天注意觀察和記錄各組大鼠的毛色、弓背、拒捕行為、不自主運動等行為。采用陳忻等〔4〕制定的魚藤酮PD大鼠神經行為學評分體系對大鼠的行為學改變進行評分，記錄造模7 d(開始電針治療)及造模28 d(電針治療結束)大鼠的行為學評分。

1.6 免疫組化染色檢測TH的表達 每組隨機選取6只大鼠以水合氯醛麻醉后，先用250 ml生理鹽水行左心室灌流，再用0.1 mmol/L的PBS配制的4%的多聚甲醛溶液灌注固定。取出腦組織置于4%的多聚甲醛溶液中繼續固定24 h，石蠟包埋后行連續冠狀切。免疫組化SABC法檢測TH。免疫組織化學圖像采用Image-Pro Plus software對切片進行圖像分析，所有切片均采用同一光強度，每個標本取相鄰的3張切片，觀察黑質區相同面積，分析陽性數密度及陽性面密度。

1.7 線粒體的提取 余下各組大鼠用水合氯醛麻醉后，于冰盤上迅速斷頭取出中腦黑質組織塊，置于液氮罐中保存。使用GENMED動物組織線粒體分離試劑盒，采用組織勻漿法提取線粒體，放進-70℃冰箱中保存。

1.8 線粒體復合物Ⅰ～Ⅳ活性檢測 運用線粒體復合物活性比色測定相應線粒體復合物的活性，具體的操作步驟參照定量檢測試劑盒產品說明書用紫外分光光度法進行測定。

1.9 統計學方法 應用SPSS17.0統計學軟件進行統計學分析。組間差異采用t檢驗分析。結果以±s表示。

2 結果

2.1 電針對PD模型大鼠行為學的影響 自造模開始3～5 d后，模型組逐漸出現毛色變臟變黃、運動緩慢、弓背、拒捕行為減弱及震顫等不自主運動，且隨著造模時間延長，上述表現逐步加重。電針治療組自造模開始3～5 d后出現上述癥狀，但造模結束時電針治療組大鼠行為學改變明顯較模型組減輕，差異顯著(P＜0.05)。正常組和溶劑對照組均未見上述行為學改變。見表1。

2.2 電針對PD模型大鼠中腦黑質區TH陽性神經元數目的影響 TH免疫組織化學染色顯示，正常組和溶劑對照組大鼠中腦黑質區有條帶狀TH免疫反應陽性產物，分布較集中(63.17±7.47，64.67±5.96);與正常組及溶劑對照組相比，模型組大鼠中腦黑質區TH表達顯著降低(25.33±3.88，P＜0.01);電針治療組大鼠中腦黑質區TH表達較模型組顯著增強(33.50±3.02，P ＜0.01)，見圖1。

2.3 電針對PD模型大鼠中腦黑質區線粒體復合物Ⅰ～Ⅳ活性的影響 模型組線粒體復合物Ⅰ較正常組顯著降低，電針治療組線粒體復合物Ⅰ較模型組顯著升高，正常組與溶劑對照組之間無顯著差異。線粒體復合物Ⅱ～Ⅳ的活性在各組間無顯著差異。見表2。

表1 模型組與電針治療組大鼠行為學評分(±s，n=12)

表1 模型組與電針治療組大鼠行為學評分(±s，n=12)

組別 造模7 d 造模28 d模型組1.5±0.53 6.8±1.35電針治療組1.6±0.52 5.0±0.94

圖1 各組大鼠腦黑質區TH陽性神經元的表達(TH，×200)

表2 各組大鼠腦黑質細胞線粒體復合物Ⅰ～Ⅳ的變化(±s，n=12)

表2 各組大鼠腦黑質細胞線粒體復合物Ⅰ～Ⅳ的變化(±s，n=12)

組別 ComplexⅠ ComplexⅡ ComplexⅢ ComplexⅣ正常組 111.42±13.25 44.88±6.39 39.33±4.98 90.23±11.11溶劑對照組 109.63±8.64 45.95±8.39 37.57±2.76 87.32±9.25模型組 51.61±3.67 42.97±8.53 34.03±4.15 91.47±10.16電針治療組 77.65±6.32 43.55±11.35 34.50±3.16 93.35±8.17

3 討論

線粒體是真核細胞內重要的細胞器，是有氧呼吸產生能量的主要場所。線粒體呼吸鏈主要由5個酶復合物 (復合物Ⅰ～Ⅴ)構成，是電子傳遞和最終合成 ATP的場所。復合物Ⅰ(NADH-CoQ還原酶)是線粒體呼吸鏈中最大的一個復合體，由NADH脫氫酶和一系列鐵硫蛋白組成。它是由mtDNA轉錄的mRNA編碼的亞單位組成，由于mtDNA易受自由基攻擊以及缺少組蛋白的保護而易發生突變〔5〕。Parkin、PINK1、DJ-1等是常染色體隱性遺傳性家族性PD常見的基因突變位點〔6，7〕。這些家族性PD相關基因編碼蛋白對維持線粒體的形態和功能具有重要的作用，例如在Parkin敲除的小鼠中發現線粒體呼吸鏈活性降低〔8〕。相關實驗也報道了PD模型動物的線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ活性明顯下降〔9～11〕。顯然，線粒體的功能障礙在PD的發病中占有重要的作用和地位。通過對整體魚藤酮PD模型大鼠的研究觀察到:動物出現行為學異常，線粒體復合物Ⅰ活性明顯降低，而線粒體復合物Ⅱ～Ⅳ的活性無顯著變化。通過對線粒體呼吸鏈整體水平的研究，證明魚藤酮造成的黑質紋狀體損傷與它抑制線粒體復合物Ⅰ的活性有直接的關系，由此推斷魚藤酮抑制線粒體復合物Ⅰ的活性是它選擇性損害DA能神經元的始動性因素。同時更進一步證明了線粒體功能障礙在PD發病中的重要地位，尤其是線粒體復合物Ⅰ的功能。針灸是治療PD重要的手段之一。臨床多有報道針灸治療該病不僅改善病人的癥狀，使美多巴減量而療效不受影響，且西藥引起的運動波動及異動癥等副作用明顯減輕〔12，13〕。本實驗中，在大鼠出現行為學改變時，即對大鼠進行電針治療，體現了中醫的“未病先防，既病防變”思想。研究中觀察到，電針治療組線粒體復合物Ⅰ的活性較模型組明顯增強，電針治療組大鼠的行為學改變較模型組顯著減輕，提示增強線粒體復合物Ⅰ活性、改善線粒體電子傳遞鏈功能可能是針刺治療帕金森病的機制之一。

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2 任曉明.針灸治療帕金森病的臨床觀察〔J〕.浙江中醫藥大學學報，2008;32(4):510-2.

3 華興邦.大鼠穴位圖譜的研制〔J〕.實驗動物與動物實驗，1991;1:1.

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5 Rego AC，Oliveira CR.Mitochondrial dysfunction and reactive oxygen species in excitotoxicity and apoptosis:implications for the pathogenesis of neurodegenerative diseases〔J〕.Neurochem Res，2003;28(10):1563-74.

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8 Rothfuss O，Fischer H，Hasegawa T，et al.Parkin protects mitochondrial genome integrity and supports mitochondrial DNA repair〔J〕.Hum Mol Genet，2009;18(20):3832-50.

9 陳 忻，張 楠，厲 春.魚藤酮帕金森大鼠呼吸鏈符合酶Ⅰ、Ⅳ的改變〔J〕.中國實驗動物學報，2009;17(2):135-7.

10 曹圓圓，包仕堯，趙合慶，等.還原型谷胱甘肽合用粉防己堿對帕金森病大鼠腦線粒體酶復合體I及活性氧的影響〔J〕.蘇州大學學報，2008;28(2):177-80.

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13 符 冰，倫 新，榮 莉，等.電針頭穴及督脈穴治療帕金森病隨機對照觀察〔J〕.中國臨床康復，2004;8(22):4524-5.