Lactuside B對(duì)腦缺血再灌注損傷后大鼠海馬和紋狀體神經(jīng)生長(zhǎng)因子 mRNA表達(dá)的影響

詹合琴 李生瑩 李平法 閆福林 (新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的再生和修復(fù)有著重要的作用，具有維持神經(jīng)元存活、參與受損神經(jīng)元修復(fù)等作用〔1〕。腦缺血后NGF的表達(dá)增多可能是產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用的內(nèi)源性機(jī)制〔2～4〕，但是這種表達(dá)的上調(diào)維持時(shí)間短，程度不強(qiáng)。高翅果菊提取物L(fēng)actuside B(LB)是從河南高翅果菊屬植物中提取得到的一種單體化合物，前期研究發(fā)現(xiàn)其具有良好的抗腦缺血作用〔5〕，但作用機(jī)制所知甚少。本實(shí)驗(yàn)探討LB對(duì)大鼠腦缺血后海馬和紋狀體NGF mRNA表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 藥品、主要試劑及儀器 尼莫地平注射液(購(gòu)于新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三附院);溴乙啶、純DEPC液、瓊脂糖、50×TAE緩沖液、D2000 DNA分子量標(biāo)記物和Trizol等產(chǎn)品(均購(gòu)于鄭州博興生物科技有限公司);loading buffer和RT-PCR試劑盒(購(gòu)于鄭州久是生物技術(shù)有限責(zé)任公司);水合氯醛粉劑、無水乙醇、異丙醇和氯仿(購(gòu)于新鄉(xiāng)市世紀(jì)元化玻器械有限公司)。DYY-7C型水平電泳儀(北京市六一儀器廠產(chǎn));Eppendorf AG PCR擴(kuò)增儀(德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn));UV-2102PC紫外分光光度計(jì)(尤尼柯上海儀器有限公司產(chǎn));TGL-16G-A臺(tái)式高速低溫離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn));SANYO MDF-U4086S超低溫冰箱(日本SANYO公司產(chǎn));TOCAN240凝膠成像系統(tǒng)(上海領(lǐng)成生物科技有限公司產(chǎn))。

1.2 實(shí)驗(yàn)樣品LB的分離鑒定 采集高翅果菊植物，取其根部陰干后粉碎，按照本實(shí)驗(yàn)小組的提取步驟和方法〔5〕，獲取足夠?qū)嶒?yàn)使用的LB(為白色粉末狀，純度＞98%)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、分組與給藥 清潔健康Ⅱ級(jí)雄性SD大鼠，體重(300±20)g，購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào):SYXK(豫)2005-0012。實(shí)驗(yàn)過程對(duì)動(dòng)物的處理符合中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)部2006年頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》標(biāo)準(zhǔn)〔6〕。動(dòng)物隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、陽性對(duì)照組(尼莫地平1 mg/kg)、LB低劑量組(12.5 mg/kg)、LB中劑量組(25 mg/kg)、LB 高劑量組(50 mg/kg)，共6 組，8 只/組，各組于再灌注后24、72 h分別處死各組動(dòng)物的一半。所有動(dòng)物于再灌后每天給藥2次，均按5 ml/kg腹腔注射給藥。假手術(shù)組、模型組分別給予等體積的生理鹽水，陽性對(duì)照組給予尼莫地平，LB低、中、高劑量組分別給予相應(yīng)劑量的實(shí)驗(yàn)藥物。

1.4 大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞線的制備 1.5號(hào)日本漁線(Da-Dong Yang生產(chǎn)制造)，直徑0.2 mm，剪成4 cm長(zhǎng)的數(shù)小段，將其末端靠近火焰燒圓，在長(zhǎng)2.0 cm處做標(biāo)記，放入多聚L賴氨酸和肝素混合(2∶1)溶液中浸泡備用。

1.5 大鼠大腦中動(dòng)脈缺血再灌注損傷模型的制備及神經(jīng)缺失癥狀評(píng)分 參照Longa線栓法和神經(jīng)缺失癥狀評(píng)分法建立大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈缺血再灌注損傷模型(阻塞線插入深度為2.0 cm，假手術(shù)組阻塞線插入ICA長(zhǎng)度為0.5 cm左右)，并對(duì)各組動(dòng)物進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，14分者為成功模型動(dòng)物。

1.6 RT-PCR方法檢測(cè)NGF基因的轉(zhuǎn)錄水平 大鼠斷頭取腦，稱取80 mg腦梗死區(qū)周圍大腦皮質(zhì)在液氮中磨碎，Trizol一步法提取總RNA，檢測(cè)其純度和濃度保證所提的RNA無降解和污染。用TaKaRa primeScript TM RT-PCR試劑盒擴(kuò)增NGF基因片段，NGF上游引物為5'-TCCACCCACCCAGTCTTCCA-3'，下游引物為5'-GCCTTCCTGCTGAGCACACA-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為344 bp。PCR反應(yīng)液為50 μl，反應(yīng)條件為:95℃ 5 min;95℃30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，30 個(gè)循環(huán);72℃ 10 min，以 β-actin為內(nèi)參，上游引物為5'-CCTTCCTGGGCATGGAGTCCTG-3'，下游引物為5'-GGAGCAATGATCTTGATCTTC-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為208 bp。PCR產(chǎn)物各取2.5 μl，1.8%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，凝膠成像分析儀拍照記錄。用Quantity One圖像分析軟件測(cè)定各條帶灰度，以擴(kuò)增的特異性目的片段灰度值與同時(shí)擴(kuò)增的內(nèi)參β-actin片段灰度值的比值作為特異性擴(kuò)增目的片段的半定量檢測(cè)值，每組每只實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，求其平均值。

2 結(jié)果

2.1 LB對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后海馬各時(shí)段NGF mRNA表達(dá)的影響 腦缺血后海馬模型組NGF基因表達(dá)明顯增多，但再灌注72 h NGF基因表達(dá)顯著下降，用藥后，LB各劑量組NGF mRNA表達(dá)增多，與模型組比較有顯著性差異(P＜0.01)，與陽性對(duì)照藥比較中、低劑量組有顯著性差異(P＜0.01);LB中、低劑量組用藥72 h后 NGF mRNA表達(dá)更多，與用藥24 h比較有顯著性差異(P＜0.05)。見表1、圖1。

2.2 Lactuside B對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后大腦紋狀體組織各時(shí)段NGF mRNA表達(dá)的影響 結(jié)果顯示:腦缺血后紋狀體模型組NGF基因表達(dá)增多，再灌注72 h時(shí)NGF基因表達(dá)顯著下降。用藥后，Lactuside B各劑量組NGF mRNA表達(dá)增加，與模型組比較有顯著性差異(P＜0.01)，與陽性對(duì)照藥比較其高、低、中、高劑量組均有顯著性差異(P＜0.01，P＜0.05);LB用藥72 h時(shí)中、低劑量組NGF mRNA表達(dá)更多，與用藥24 h比較有顯著性差異(P＜0.05)。見表2、圖1。

表1 各組大鼠海馬不同時(shí)段NGF mRNA的表達(dá)(n=8，±s)

表1 各組大鼠海馬不同時(shí)段NGF mRNA的表達(dá)(n=8，±s)

與模型組比較:1)P＜0.01;與陽性對(duì)照藥比較:2)P＜0.01;與缺血再灌24 h比較:3)P＜0.05

組別 缺血再灌24 h 缺血再灌72 h假手術(shù)組0.21±0.01 0.19±0.01模型組 0.27±0.01 0.23±0.00陽性對(duì)照藥組 0.36±0.021) 0.38±0.011)LB低劑量組 0.44±0.011)2) 0.48±0.021)2)3)LB中劑量組 0.68±0.021)2) 0.73±0.011)2)3)LB高劑量組 0.35±0.021) 0.40±0.021)

表2 各組大鼠紋狀體不同時(shí)段NGF mRNA的表達(dá)(n=8，±s)

表2 各組大鼠紋狀體不同時(shí)段NGF mRNA的表達(dá)(n=8，±s)

與模型組比較:1)P＜0.01;與陽性對(duì)照藥比較:2)P＜0.01，3)P＜0.05;與24 h比較:4)P＜0.05

組別IR 24 h IR 72 h假手術(shù)組0.24±0.01 0.19±0.01模型組 0.30±0.01 0.22±0.01陽性對(duì)照組 0.33±0.011) 0.42±0.021)LB低劑量組 0.52±0.011)2) 0.75±0.021)2)4)LB中劑量組 0.66±0.011)2) 1.01±0.021)2)4)LB高劑量組 0.35±0.001)3) 0.46±0.021)3)

圖1 各組大鼠海馬、紋狀體不同時(shí)段NGF mRNA的表達(dá)

3 討論

腦部的血液供應(yīng)主要靠頸內(nèi)動(dòng)脈系統(tǒng)和椎-基底動(dòng)脈系統(tǒng)。其中脈絡(luò)前動(dòng)脈主要供應(yīng)紋狀體、海馬、外側(cè)膝狀體等組織區(qū)域，而后交通動(dòng)脈、大腦前動(dòng)脈和大腦中動(dòng)脈主要供應(yīng)眼部和大腦半球前3/5部分的血液〔7〕。一旦發(fā)生腦缺血性事件，腦部供血?jiǎng)t嚴(yán)重受阻，除了大腦皮質(zhì)的缺血性損傷外，海馬和紋狀體組織對(duì)缺血和再灌注損傷也非常敏感〔8，9〕。

腦缺血是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，是全世界因腦血管疾病致殘的重要病因。缺血性腦中風(fēng)的類型在臨床上以大腦中動(dòng)脈阻塞(MCAO)為主，腦缺血再灌注后大腦皮質(zhì)、海馬和紋狀體的神經(jīng)元會(huì)發(fā)生損傷，隨著病情的加重更會(huì)造成神經(jīng)元的死亡。目前，減少神經(jīng)元死亡，促進(jìn)損傷腦組織的修復(fù)等神經(jīng)保護(hù)措施在臨床上仍然占有十分重要的地位。

有許多研究證明，腦缺血再灌注損傷后具有自我修復(fù)的潛力，且其修復(fù)與非神經(jīng)元區(qū)的神經(jīng)再生以及神經(jīng)生長(zhǎng)因子的表達(dá)有著密切的關(guān)系〔10，11〕。腦缺血缺氧后，NGF的應(yīng)激性表達(dá)上調(diào)可改善神經(jīng)元的病理狀態(tài)〔12〕。

本實(shí)驗(yàn)選擇大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞再灌注模型，研究了LB對(duì)腦缺血再灌注損傷后大鼠海馬和紋狀體NGF mRNA的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LB在不同時(shí)段均可上調(diào)二部位NGF mRNA的表達(dá)，中低劑量組的作用效果優(yōu)于陽性對(duì)照藥尼莫地平，且用藥72 h NGF mRNA表達(dá)更多。這些結(jié)果提示了LB對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用可能與其能夠維持海馬和紋狀體高水平的內(nèi)源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子有關(guān)。

眾所周知，NGF的分子量很大難以透入血腦屏障，故用其治療腦缺血損傷在臨床上難以湊效。LB能夠增加內(nèi)源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子表達(dá)的機(jī)制在分子水平上揭示了其抗腦缺血再灌注損傷的一角，為L(zhǎng)B作為抗腦缺血損傷新藥的進(jìn)一步研究提供了一定的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論基礎(chǔ)。

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