甲珠對肝纖維化鼠基質金屬蛋白酶表達的影響

付德才 李 勇 張煒婷 (無錫市第五人民醫院肝病研究所，江蘇 無錫 24007)

肝纖維化作為肝硬化的前期階段，其可逆性為延緩或阻止各種慢性肝病發展為肝硬化提供了可能性，對肝纖維化的防治已成為該領域的研究熱點。近年來研究顯示許多中醫方藥對肝纖維化有很好的治療效果。甲珠為穿山甲的鱗片，主歸肝經，具有軟堅、通絡、散結的功效，是歷代醫家治療癥、瘕、集、聚的常用藥，近年來被廣泛用治肝硬化取得了較好的臨床效果。但目前國內外尚無甲珠抗肝纖維化的基礎及臨床研究。本實驗采用大鼠肝纖維化模型，觀察甲珠的抗肝纖維化作用，并探討其對基質金屬蛋白酶13(MMP-13)、基質金屬蛋白酶抑制因子1(TIMP-1)的影響，探討甲珠抗肝纖維化的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物及藥物 雄性Wistar大鼠90只，體重(180±30)g，22月齡，由吉林大學實驗動物中心提供。甲珠(由牡丹江中醫院提供)研細末，高劑量組為2.0 g/kg(體重)，中劑量組為1.0 g/kg(體重)，低劑量組為0.5 g/kg(體重)。

1.1.2 藥品及試劑 四氯化碳(CCl4)購自北京北化精細化學品有限責任公司:秋水仙堿(colchicine)購自昆明股份制藥有限公司;谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)試劑盒購自上海科欣生物技術研究所;血清總膽紅素(TBIL)試劑盒購自上海科華東菱診斷用品有限公司;透明質酸(HA)、層黏連蛋白(LN)放射免疫分析測定盒購自上海海軍醫學研究所生物技術中心;兔抗大鼠MMP-13、TIMP-1多克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司，即用型SP免疫組化試劑盒購自福州邁新試劑公司，DAB購自北京中山生物公司。RT-PCR兩步法試劑盒購自TAKARA公司，Trizol購自Sangon公司。

1.2 方法

1.2.1 模型制作 參照文獻〔1〕方法。實驗第1天除正常空白對照組(簡稱對照組)外，其余動物皮下注射 CCl4分析純0.5 ml/100 g體重，以后每隔3 d注射40%CCl4橄欖油劑0.3 ml/100 g體重，連續8 w。實驗前2 w飼喂高脂玉米粉飼料(79.5%玉米粉+20%豬油+0.5%膽固醇)，第3～6周飼喂100%玉米粉和30%乙醇飲料。

1.2.2 分組及給藥方法 采用成組設計，將90只大鼠隨機分為6組，每組15只，第1組對照組，飼喂正常飲食;第2組模型組，按上述造模方法給予飲食;第3組秋水仙堿組，于造模第3周開始給予秋水仙堿0.1 mg·kg-1·d-1，第4組甲珠高劑量治療組，于造模第3周開始，給予甲珠混懸液灌胃，每日2.0 g/kg;第5組甲珠中劑量治療組，于造模第3周開始，給予甲珠混懸液灌胃，每日1.0 g/kg;第6組甲珠高劑量治療組，于造模第3周開始，給予甲珠混懸液灌胃，每日0.5 g/kg;共8 w。

1.2.3 標本制作 上述造模及處理過程結束日，禁食12 h后稱質量，心包取血，分離血清置-20℃保存;并立刻完整摘取肝臟及脾臟，稱質量后用生理鹽水漂洗肝左葉數次，濾紙拭干后，切取0.2 g置于冰浴中的組織勻漿器內，加入冰生理鹽水2 ml，制備成100 g/l肝組織勻漿，4 000 r/min 4℃離心，取上清液保存于-20℃。肝右葉置于40 g/L中性甲醛液中常規固定后，石蠟包埋，用于制作組織芯片。

1.2.4 血清及組織纖維化指標檢測 測定血清肝功能包括TBIL(總膽紅素)、ALT白蛋白(ALB)、A/G，檢測透明質酸(HA)，PCⅢ(Ⅲ型前膠原)，LN含量(放射免疫分析法):肝勻漿檢測羥脯氨酸(HYP)含量(二甲氨基苯甲醛法)，檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所，均按試劑盒說明書操作。

1.2.5 病理檢測 組織芯片分別行常規蘇木素-伊紅(HE)染色，Masson三色染色(染膠原纖維)及網織纖維染色，光鏡下觀察，并根據我國學者王泰齡等改進的肝纖維化半定量評分系統(SSS)〔2〕進行炎癥活動度及肝纖維化程度計分。

1.2.6 免疫組織化學檢查 MMP-13、TIMP-1采用石蠟包埋常規切片，SP法，兔抗鼠MMP-13、TIMP-1多克隆抗體工作濃度分別以1∶300和1∶240稀釋，二氨基聯苯胺(DAB)顯色，蘇木素復染。磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照。陽性組織呈棕色，陰性組織呈藍色，在全自動圖像分析系統上，采用HPIAS-2000型圖像分析軟件進行定量分析，隨機選取每張切片10個視野(×200)倍測定陽性細胞的灰度值與所占視野面積。

1.2.7 RT-PCR 大鼠GAPDH上游引物:5'CATGACCACAGTCCATGCCATC3'，下游引物:5'CACCCTGTTGCTGTAGCCATATTC 3'全長 750 bp:TIMP-1上游引物:5'GCCATGGAGAGCCTCTGTGG 3'，下游引物:5'GCAGGCAGGCAAAGTGATCG3'全長493 bp。稱取50～100 mg肝組織用Trizol提取總RNA，采用分光光度法測定其含量及純度，測定A260/A280值。取2 μg總RNA，42℃逆轉錄90 min。參數設置94℃變性，3 min×1循環。94℃變性30 s，53℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35個循環。最后72℃徹底延伸7 min×1循環。同法擴增GAPDH作為內參照。取5 μl PCR產物1.5%瓊脂糖凝膠電泳。凝膠圖像分析系統檢測光密度值，TIMP-1/GAPDH比值表示TIMP-1 mRNA相對水平。

1.3 統計學分析 應用SPSS11.0統計軟件進行分析，實驗結果數據以±s表示，各組間比較采用單因素方差分析，記數單位采用秩和檢驗。

2 結果

2.1 各組大鼠肝功能改變 模型組ALT、AST顯著升高，ALB顯著降低;干預組ALT、AST較模型組明顯降低，ALB顯著升高。

2.2 各組大鼠血清纖維化檢查結果 與正常組相比，模型組大鼠肝纖維化各項指標HA、LN、PCⅢ、肝羥脯氨酸明顯升高，q值分別為27.69、21.55、15.81、13.32(P ＜0.01);秋水仙堿干預組與模型組比較，HA、LN及PCⅢ、肝羥脯氨酸明顯降低，q值分別為:4.22、4.17、8.69、4.87(P ＜0.01);甲珠高劑量組與模型組比較，HA、LN及PCⅢ、肝羥脯氨酸明顯降低，q值分別為:5.68、5.76、9.25、3.74(P ＜0.01);甲珠中劑量組與模型組比較，HA、LN及PCⅢ、肝羥脯氨酸明顯降低，q值分別為:2.47、2.16、2.92、2.09，P 值分別為:0.017、0.035、0.049、0.041(P ＜0.05);甲珠中劑量組與模型組比較，HA、LN及PCⅢ、HYP明顯降低，q 值分別為:2.03、2.05、2.32、2.05(P ＜0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清HA、LN、PCⅢ及肝組織羥脯氨酸含量變化(n=15，±s)

表1 各組大鼠血清HA、LN、PCⅢ及肝組織羥脯氨酸含量變化(n=15，±s)

與模型組比較:1)P＜0.01，2)P＜0.05;與正常對照組比較:3)P＜0.01

組別 HA(ng/ml) LN(ng/ml) PCⅢ(μg/L) 肝HYP(μg/mg prot)正常對照組 112.27±8.51 51.18±6.73 24.63±3.52 0.16±0.023模型組 284.52±15.793) 182.26±16.723) 65.56±7.063) 0.49±0.0693)秋水仙堿組 258.25±13.371) 156.92±13.011) 43.08±4.601) 0.37±0.0591)甲珠高劑量組 249.15±14.131) 147.21±13.681) 41.65±4.201) 0.398±0.0551)甲珠中劑量組 269.13±14.682) 169.11±16.082) 58.02±5.792) 0.439±0.0472)甲珠低劑量組 271.89±15.182) 169.77±13.052) 59.56±8.032) 0.44±0.0682)

2.3 組織形態學改變 肝臟HE染色顯示，正常大鼠可見少量膠原著色，病理模型組肝小葉結構破壞，纖維組織增生明顯，將肝小葉分隔成大小不等的肝細胞團，肝細胞廣泛變性壞死，匯管區擴大、膠原沉積。甲珠干預各組肝細胞有不同程度的變性壞死，匯管區及小葉間有少量纖維組織增生，纖維間隔細小，與模型組比較差異顯著。秋水仙堿干預組肝細胞有不同程度的變性壞死，匯管區及小葉間有少量纖維組織增生，肝細胞內可見脂肪沉積(χ2=53.29，P＜0.01)，甲珠干預各組及秋水仙堿干預組較模型組纖維化程度減輕(P＜0.001)。見表2。

表2 大鼠肝纖維化的分級(n)

2.4 RT-PCR 正常肝組織幾乎不表達TIMP-1 mRNA，TIMP-1/GAPDH比值為0.05±0.009，而模型組為強表達，TIMP-1/GAPDH比值為0.39±0.030，遠高于正常組，q=38.15(P＜0.01);秋水仙堿干預組TIMP-1/GAPDH比值為0.12±0.008，與模型組比較q=-30.37(P＜0.01)，TIMP-1 mRNA表達低于模型組，有統計學意義;甲珠高劑量干預組TIMP-1/GAPDH比值為0.08±0.008，與模型組比較q=-34.816(P＜0.01)。甲珠中劑量干預組TIMP-1/GAPDH比值為0.17±0.017，與模型組比較q=-24.81(P＜0.01)。甲珠低劑量干預組TIMP-1/GAPDH比值為0.27±0.032，與模型組比較q=-13.68(P＜0.01)。見圖1。見細胞核表達。甲珠干預組陽性染色程度均較模型組明顯升高。TIMP-1在胞漿表達，正常對照組偶見個別間質細胞表達TIMP-1。模型組TIMP-1主要表達在纖維間隔內、匯管區和竇周纖維化等部位間質細胞內表達，纖維間隔以及匯管區周圍的部分肝細胞胞漿中亦呈陽性表達，免疫組化陽性著色位于細胞胞質中，未見細胞核表達。呈長橢圓形或梭形，甲珠干預組陽性染色程度均較模型組明顯降低。見圖2。

采用HPIAS-2000型圖像分析軟件進行定量分析，測定陽性細胞的灰度值與所占視野面積，灰度值在0～249之間，灰度值越高，染色越淺，表達產物越少;灰度值越低，染色越深，表達產物越多。模型組MMP-13及TIMP-1灰度值，與正常組比較，q值分別為-4.18、-7.21(P＜0.01)。模型組MMP13及TIMP-1灰度值，與秋水仙堿組比較，q值分別為3.62、-3.01(P＜0.01)。模型組MMP-13及TIMP-1灰度值，與甲珠高劑量組比較，q值分別為4.11、-3.79(P＜0.01)。模型組 MMP-13及TIMP-1灰度值，與甲珠中劑量組比較，q值分別為2.64、-2.29(P＜0.05)。模型組MMP-13及TIMP-1灰度值，與甲珠低劑量組比較，q值分別為2.04、-2.01(P＜0.05)。模型組MMP-13及TIMP-1免疫組化染色面積，與正常組比較，q值分別為13.69、21.36(P＜0.01);模型組MMP-13及TIMP-1免疫組化染色面積，與秋水仙堿組比較，q值分別為 -4.34、5.21(P＜0.01);模型組MMP-13及TIMP-1免疫組化染色面積，與甲珠高劑量組比較，q值分別為-8.75、9.19(P＜0.01);模型組MMP-13及TIMP-1免疫組化染色面積，與甲珠中劑量組比較，q值分別為-4.30、4.73(P＜0.01);模型組 MMP-13及TIMP-1免疫組化染色面積，與甲珠低劑量組比較，q值分別為-2.56、3.80(P ＜0.05)。見表3，表4。

圖1 TIMP-1 mRNA RT-PCR圖

2.5 免疫組化結果 正常組肝組織中幾乎不表達MMP-13，模型組MMP-13主要表達在纖維間隔內、匯管區和竇周纖維化等部位間質細胞內表達，纖維間隔以及匯管區周圍的部分肝細胞胞漿中亦呈陽性表達，免疫組化陽性著色位于細胞胞質中，未

表3 各組大鼠肝組織MMP-13、TIMP-1表達的灰度值(±s)

表3 各組大鼠肝組織MMP-13、TIMP-1表達的灰度值(±s)

與模型組比較:1)P＜0.01;與正常對照組比較:2)P＜0.05，3)P＜0.01

組別 n MMP-13 TIMP-1正常對照組15 149.26 ±10.07 142.07 ±10.04模型組 15 128.46±12.243) 103.07±13.363)秋水仙堿組 15 110.44±10.561) 119.35±10.511)甲珠高劑量組 15 108.00±11.361) 123.55±14.071)甲珠中劑量組 15 115.33±11.182) 115.41±11.002)甲珠低劑量組 15 118.31±11.022) 113.96±13.022)

表4 各組大鼠肝組織MMP-13、TIMP-1表達的陽性面積百分比(±s，%)

表4 各組大鼠肝組織MMP-13、TIMP-1表達的陽性面積百分比(±s，%)

與模型組比較:1)P＜0.01;與正常對照組比較:2)P＜0.01

組別 n MMP-13 TIMP-1正常對照組15 3.26 ±0.32 4.16±0.19模型組 15 11.06±1.442) 15.40±1.422)秋水仙堿組 15 13.53±1.221) 12.66±1.431)甲珠高劑量組 15 16.04±1.371) 10.56±1.051)甲珠中劑量組 15 13.51±1.571) 12.91±1.381)甲珠低劑量組 15 12.51±1.321) 13.40±1.101)

圖2 各組于造模結束時肝組織MMP-13、TIMP-1免疫組化圖(×200)

3 討論

目前的研究認為，肝纖維化的病理改變是細胞外基質(ECM)的增生和降解失衡所致，而病理情況下ECM的主要細胞來源是肝星狀細胞(HSC)，激活和增生在肝纖維化過程中起主要作用〔3，4〕，HSC激活形成的肌成纖維樣細胞是肝纖維化ECM的主要來源細胞，肌成纖維樣細胞能合成幾乎所有的ECM，并且通過以下等多條途徑參與肝纖維化的發生與發展〔5，6〕。慢性炎癥反應過程可導致氧化應激的增加和降低胞內抗氧化能力〔7〕，加劇ECM產生是肝纖維化發生途徑中的重要環節之一。MMPs是一類Ca2+-Zn2+離子依賴的內源性蛋白酶，肝內主要由HSC合成，可降解多種ECM成分，其活性可被相應的TIMPs所抑制。TIMPs在肝臟主要由 HSC表達，并常與MMPs共分泌。MMP-1(在鼠MMP-13)主要降解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型間質膠原。研究表明，肝纖維化時，TIMPs與MMPs基質降解活性呈負相關，TIMP-1與活性MMP-13以1∶1摩爾比結合形成復合體，從而抑制MMP-13的活性，阻礙了肝內多余膠原的降解，加速了肝纖維化進程，其中間質膠原酶MMP-1(在鼠MMP-13)在肝纖維化過程明顯減少，而TIMP-1增加亦能反應肝纖維化的嚴重程度〔8～10〕。從祖國醫學辯證，認為肝纖維化是由于氣滯、血瘀、絡阻所致，肝纖維化初期主要為氣滯，進而血瘀，最后絡阻，氣機不暢，肝纖維化、肝硬化形成。甲珠為穿山甲的鱗片，主歸肝經，具有軟堅、通絡、散結的功效，是歷代醫家治療癥、瘕、集、聚的常用藥，近來，被廣泛用治肝硬化取得了較好的臨床效果。本試驗結果:甲珠干預組ALT、AST較模型組明顯降低，ALB較模型組明顯升高，兩者比較差別顯著;血清中各纖維化指標HA、LN、PCⅢ、及肝組織中羥脯氨酸含量甲珠各組較模型組明顯降低;甲珠從組織學上具有減少試驗鼠肝纖維化形成的作用，病理HE染色，Masson三色染色膠原含量較模型組明顯降低，病理分級明顯改善，兩者比較差別顯著;甲珠能夠減少或阻抑試驗鼠TIMP-1的表達，升高MMP-13表達，免疫組化證實甲珠干預各組TIMP-1肝組織的表達量較模型組明顯降低，MMP-13表達量較模型組明顯升高(P＜0.05)，RT-PCR證實甲珠干預各組TIMP-1 mRNA表達量較模型組明顯降低，甲珠對試驗鼠肝纖維化有良好的防治和逆轉作用。

1 于世瀛，賁長恩，楊美娟，等.免疫性和化學性損傷肝纖維化動物模型的比較〔J〕.實驗動物科學與管理，1995;12(4):5-6.

2 中華肝臟病學會肝纖維化學組.肝纖維化診斷及療效評估共識〔J〕.中華肝臟病雜志，2002;10(5):327-8.

3 Sakata R，Ueno T，Nakamura T，et al.Green tea polyphenol epigallocatechin-3-gallate inhibits platelet derived growth factor-induced proliferation of human hepatic stellate cell line LI90〔J〕.J Hepatol，2004;40(1):52-9.

4 Isono M，Soda M，Inoue A，et al.Reverse transformation of hepatic myofibroblast-like cells by TGF betal/LAP〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2003;311(4):959-65.

5 Kinnman N，Francoz C，Barbu V，et al.The myofibroblast conversion of peribiliary fibrogenic cells distinct from hepatic stellate cells is stimulated by platelet-derived growth factor during liver fibrogenesis〔J〕.Lab Invest，2003;83(2):163-73.

6 Gressner AM，Weiskirchen R.Modern pathogenetic concepts of liver fibrosis suggest stellate cells and TGF-beta as major players and therapeutic targets〔J〕.J Cell Mol Med，2006;10:76-99.

7 崔 玨，肖 瀛，王 斌，等.硫辛酸改善高脂小鼠氧化應激和慢性炎癥的研究〔J〕.中國免疫學雜志，2010;26(7):583-6.

8 Matrisian LM.The matrix-degrading metalloproteinases〔J〕.Bioessays，1992;14(7):455-63.

9 Iredale JP.Tissue inhibitors of metalloproteinases in liver fibrosis〔J〕.Int J Biochem Cell Biol，1997;29(1):43-54.

10 Murawaki Y，Ikuta Y，Idobe Y，et al.Tissue inhibitor of metalloproteinases-1 in the liver of patients with chronic liver disease〔J〕.J Hepatol，1997;26(6):1213-9.