番茄突變體jai1-1高效篩選—再生體系的建立

范錫麟，王少嶺，肖應(yīng)輝，王志龍

(湖南省作物種質(zhì)創(chuàng)新與資源利用重點實驗室/湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，長沙410128)

番茄是茄科(Solanaceae)番茄屬(Lycopersicon)植物，其分布廣泛，營養(yǎng)豐富，是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物。一方面由于各種病蟲害的發(fā)生，不同程度地影響著番茄的品質(zhì)和產(chǎn)量，甚至造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失［1］;另一方面，番茄基因組較小、遺傳背景清楚、突變體材料豐富、易于遺傳轉(zhuǎn)化，是果實發(fā)育生物學(xué)研究的模式植物。研究發(fā)現(xiàn)，COI1基因編碼一個F－box蛋白，是茉莉酸甲酯(MeJA)的受體，與Skp1－Cullin－Rbx1相互作用構(gòu)成SCF復(fù)合物，參與植物胚胎發(fā)育、性別決定［2］、植物與病原菌的互作［3］、自交不親和性［4］、細(xì)胞凋亡［5，6］、光信號途徑及植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。擬南芥中COI突變體coi1-1對Me-JA不敏感，表現(xiàn)為花粉活力降低而導(dǎo)致雄性不育，并對病原菌的侵染易感，研究還發(fā)現(xiàn)COI1基因的異位表達(dá)能部分恢復(fù)花粉育性［7，8］;而番茄 COI1相似基因JAI1的突變體jai1-1表現(xiàn)為腺毛發(fā)育不全，花粉活力降低并表現(xiàn)出雌性不育，對棉葉螨敏感以及依賴于JA的基因表達(dá)的功能缺陷［9］。通過比對分析番茄、大豆、擬南芥和水稻中COI1同源基因的蛋白序列，發(fā)現(xiàn)其有很高的同源性，這暗示了COI1基因在進(jìn)化上的保守性。實驗室已克隆得到了大豆、番茄、擬南芥和水稻中的COI1同源基因，并構(gòu)建了一整套用于研究COI1功能及信號通路的相關(guān)植物表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化番茄jai1-1突變體，希望從第三方的角度來了解基因在植物進(jìn)化中的共性和特異性。本實驗擬建立番茄突變體jai1-1的高效篩選—再生體系，以提高農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化效率，為后續(xù)番茄的遺傳育種和功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

番茄野生型JAI1和含有突變體jai1-1的F2種子均由本實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 種子消毒

用濃度75%酒精消毒1 min，無菌水沖洗2次。再將種子用濃度為10%(m/v)的Ca(ClO)2溶液滅菌20 min。無菌水沖洗4～5次，無菌濾紙吸干后接種于1/2 MS固體培養(yǎng)基中。

1.2.2 培養(yǎng)條件

將接種好的種子和子葉及下胚軸置于組培室中，26℃恒溫培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為2 000～2 500 lx，光周期為14 h。

1.2.3 jai1-1突變的篩選

待種子萌發(fā)至約1 cm時，轉(zhuǎn)移至含有不同濃度JA(茉莉酸)的1/2 MS固體培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選，5 d后選取根部能正常生長的種子重新接回不添加任何激素的1/2 MS固體培養(yǎng)基中，作為進(jìn)一步實驗的材料，其他種子直接種植于營養(yǎng)土中。

1.2.4 愈傷組織的誘導(dǎo)及不定芽的分化

以番茄幼嫩子葉和下胚軸作為實驗材料。在第1片真葉長出前，切去番茄子葉的尖端和底部，將子葉二分，切成約0.5 cm×0.5 cm的外植體，子葉上表皮朝下倒置接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中［10］;下胚軸中段切成約1 cm的長度，接種于不同激素組合的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中(表1)，每個培養(yǎng)皿接種10個，每種培養(yǎng)基接 3 個重復(fù)，每隔兩周進(jìn)行一次繼代培養(yǎng)［11，12］，30 d后觀察并記錄實驗結(jié)果。

表1 不同處理的誘導(dǎo)培養(yǎng)基激素組合

1.2.5 不定根的誘導(dǎo)

待幼芽長至2.0～3.0 cm，3～4片葉時，選取長勢良好，生長健壯的芽體，切除基部愈傷組織及培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)接至添加有不同激素組合的生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根(表5)，每瓶接種4～5個幼芽，一周后觀察并記錄實驗結(jié)果。

1.2.6 試管苗移栽

待試管苗根系發(fā)達(dá)，長至6～8 cm高時，打開瓶口，保濕后置于組培室中。5～7 d后取出試管苗，洗去根部殘余培養(yǎng)基后移栽到裝有營養(yǎng)土的花缽中，澆適量水待其正常生長成植株。

1.2.7 基因型鑒定

采用CTAB法提取經(jīng)組織培養(yǎng)形成植株的番茄葉片DNA，設(shè)計基因特異性引物PCR，鑒定不同濃度MeJA對jai1-1突變體的篩選效果［9］。

F1:5'－ GTGGAGACGATATGTTGAGACTAA－3'

F2:5'－ CCATGGAGTCCATCACCTAACAGT－3'

F3:5'－ GTGGTCAGATCAGAGCCCTCTATT－3'

分別以F1、F2和F1、F3為引物，以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。10 μL PCR反應(yīng)體系:DNA 1 μL，上游引物(10 μM)1 μL，下游引物(10 μM)1 μL，10 × Buffer 1 μL，dNTPs 0.2 μL，rTaq 0.1 μL，ddH2O 5.7 μL。

反應(yīng)程序為:95℃預(yù)變性5 min;每個循環(huán)條件為:95℃變性 30 s，56℃退火 30 s，72℃延伸 45 s，共進(jìn)行35個循環(huán);72℃終延伸10 min;反應(yīng)結(jié)束于16℃保存。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖電泳檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同MeJA濃度對jai1-1突變體的篩選

由于番茄jai1-1突變體表現(xiàn)為雌性不育而不能正常結(jié)實，因此只能從F2群體中分離得到。以JAI1種子作為對照組，在不添加MeJA的1/2 MS固體培養(yǎng)基中，全部種子都能正常生長;以F2群體種子作為實驗組，一部分不經(jīng)過MeJA處理，發(fā)現(xiàn)其能夠正常生長;另一部分用不同濃度MeJA處理，發(fā)現(xiàn)只有極少數(shù)種子對MeJA不敏感，其生長不受影響，表現(xiàn)出與對照組一致的生長狀態(tài)，其基因型應(yīng)為jai1-1;而大部分種子的生長都受到明顯抑制，具體表現(xiàn)為下胚軸和子葉較正常組短小，胚根基部呈紫紅色，生長緩慢，其基因型應(yīng)為JAI1和JAI1/jai1-1。其中，實驗組在含100 μM/L MeJA的篩選培養(yǎng)基中，抑制效果最為明顯，后將其轉(zhuǎn)移至誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)愈傷組織的誘導(dǎo)和不定芽的分化都明顯低于其他組合。

表2 不同MeJA濃度對jai1-1的篩選效果

2.2 不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

JAI1和jai1-1 兩個番茄品種的子葉和下胚軸在表1所列的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中都能誘導(dǎo)出愈傷組織。下胚軸在7 d左右可形成愈傷組織，且下胚軸誘導(dǎo)的愈傷組織增殖旺盛，生長快。實驗發(fā)現(xiàn)，下胚軸誘導(dǎo)的愈傷組織表現(xiàn)出明顯的極性，形態(tài)學(xué)上端的愈傷組織出現(xiàn)早，生長快，分裂旺盛;形態(tài)學(xué)下端的只形成少量愈傷組織，且生長緩慢，幾乎不進(jìn)行增殖分化。其中，處理7和處理8中誘導(dǎo)的愈傷組織生長最快，組織致密，呈白色或乳白色，經(jīng)繼代培養(yǎng)后只進(jìn)行分裂增殖并逐漸褐化，喪失進(jìn)一步的分裂生長能力。其他激素組合的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)的愈傷組織生長相對較慢，組織較稀疏，經(jīng)繼代后表面逐漸形成綠色顆粒狀突起，進(jìn)一步分化出不定芽并形成完整的植株。

2.3 不同激素組合及不同外植體對不定芽分化的影響

表3 不同激素組合誘導(dǎo)子葉不定芽分化率的比較

表4 不同激素組合誘導(dǎo)下胚軸不定芽分化率的比較

實驗發(fā)現(xiàn)，不同類型番茄外植體對不定芽的分化有顯著影響。其中，下胚軸誘導(dǎo)的愈傷組織比子葉生長的快，但不定芽分化率低(表3和表4)。其中部分芽體生長慢，畸形芽比例高，失去進(jìn)一步的分化能力。含2，4－D(處理7和處理8)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)的愈傷組織經(jīng)繼代后表面形成白色的致密組織，生長極其緩慢，無法分化出不定芽。繼代時將2，4－D變換為IAA或NAA，愈傷組織逐漸褐化死亡，無不定芽的分化。有研究認(rèn)為2，4－D能強(qiáng)烈抑制胚胎發(fā)生的基因程序表達(dá)［13，14］，降低內(nèi)源IAA的含量，抑制不定芽的分化。在含有ZT和IAA以及6-BA和IAA組合的培養(yǎng)基中，愈傷組織的誘導(dǎo)率都接近100%，且6-BA和IAA的激素組合形成愈傷的速度較ZT和IAA組合快，但后期的分化率較低，并表現(xiàn)為明顯的時序性，即先形成大量愈傷，再在愈傷組織表面形成綠色組織，進(jìn)一步形成芽原基直至分化出不定芽。而ZT和IAA組合愈傷組織的誘導(dǎo)和不定芽的分化幾乎是同步的，在形成少量愈傷組織的同時就會誘導(dǎo)不定芽的分化，且芽體生長速度快，畸形芽比例低。而下胚軸不定芽的誘導(dǎo)表現(xiàn)出明顯的極性，形態(tài)學(xué)上端不定芽分化早，生長快;形態(tài)學(xué)下端愈傷生長緩慢，幾乎不誘導(dǎo)形成不定芽。相同條件下子葉誘導(dǎo)不定芽的效率明顯高于下胚軸，且分化系數(shù)較高，芽體生長較快，畸形芽比例較低。另外，激素誘導(dǎo)愈傷組織和不定芽分化也表現(xiàn)出一定的基因型依賴性［15，16］。jai1-1子葉和下胚軸誘導(dǎo)愈傷的生長速度明顯慢于JAI1，芽體數(shù)量、分化率也明顯低于JAI1。在繼代培養(yǎng)過程中有的芽體因畸形芽比例偏高而無法正常生長，因此，不定芽分化過程中，保證芽體數(shù)量和芽體的正常生長是關(guān)鍵。實驗結(jié)果表明，對于JAI1，處理5和處理6中誘導(dǎo)不定芽的分化率無明顯差別;而對于jai1-1，子葉和下胚軸誘導(dǎo)不定芽分化的最佳培養(yǎng)基為MS+ZT 2.0 mg/L+IAA 0.2 mg/L。

2.4 不同激素組合對生根的影響

在添加有NAA的培養(yǎng)基中生根迅速，5～6 d后可見愈傷組織基部膨大長出幼根，10 d左右不定根數(shù)目增多，并很快長出側(cè)根，幼苗生長旺盛。而在添加有IAA的培養(yǎng)基中生根相對較慢，不定根數(shù)目較少，根細(xì)且長，幼苗生長相對緩慢。且JAI1和jai1-1在添加有NAA 0.1 mg/L和NAA 0.2 mg/L的兩種生根培養(yǎng)基中的生根效果無明顯差異(表5)。

表5 不同激素組合誘導(dǎo)生根的效果比較

2.5 PCR檢測結(jié)果

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖1)，1 號為空白對照;5，9，11，13，14 和19 號番茄基因組DNA只能擴(kuò)增出大小約為500 bp的條帶，應(yīng)為JAI1;2，16和20號只能擴(kuò)增出大小約為750 bp的條帶，應(yīng)為 jai1-1;6，7，8，10，12，15，17，21 和 22 號則能擴(kuò)增出500 bp和750 bp大小的兩條帶，應(yīng)為JAI1/jai1-1雜合子，這與實驗預(yù)期完全相符;而3號和4號未擴(kuò)增出目的條帶，可能是提取的DNA質(zhì)量較差所致。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)MeJA篩選后的材料全部表現(xiàn)為jai1-1基因型，且表現(xiàn)為JAI1和JAI1/jai1-1基因型的都是經(jīng)MeJA篩選敏感而直接種植于營養(yǎng)土中的材料。說明通過這種方法建立起了番茄突變體jai1-1的高效篩選—再生體系。

圖1 PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測

3 結(jié)論與討論

實驗發(fā)現(xiàn)，番茄愈傷組織在繼代培養(yǎng)過程中往往容易發(fā)生褐化，為防止愈傷組織褐化，保持旺盛的增殖分化能力，應(yīng)縮短繼代時間的間隔。也可在繼代培養(yǎng)時加入一定濃度的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、抗壞血酸或活性炭［17］。有研究認(rèn)為黑暗或弱光處理也能顯著降低褐化程度，但會影響不定芽的分化和光的形態(tài)建成。

實驗結(jié)果表明，ZT和IAA的激素組合誘導(dǎo)子葉和下胚軸產(chǎn)生不定芽的分化率明顯高于6-BA和IAA的組合，在相同條件下子葉誘導(dǎo)不定芽的分化率明顯高于下胚軸。相同條件下，jai1-1不定芽的誘導(dǎo)率又明顯低于JAI1。原因可能是jai1-1是突變體，JAI1基因編碼的蛋白COI1是茉莉酸甲酯MeJA的受體，其可能因JA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的缺陷而表現(xiàn)出對某些激素的超敏或者不敏感［18，19］。實驗發(fā)現(xiàn)，1/2 MS+50 μM/L MeJA是突變體jai1-1篩選的有效培養(yǎng)基。野生型JAI1和突變體jai1-1在MS+6-BA 2.0 mg/L+IAA 0.2 mg/L誘導(dǎo)愈傷組織的效果最好;JAI1在MS+ZT 1.0 mg/L+IAA 0.1 mg/L誘導(dǎo)分化不定芽的效率最高，而jai1-1則以MS+ZT 2.0 mg/L+IAA 0.2 mg/L為佳;1/2 MS+NAA 0.1 mg/L是兩者誘導(dǎo)生根的理想培養(yǎng)基。實驗還發(fā)現(xiàn)，JAI1和JAI1/jai1-1與jai1-1的比例嚴(yán)重偏離3∶1的理論值，大致上為8∶1～12∶1，這可能與受精作用及胚胎發(fā)育的缺陷有關(guān)。在植株發(fā)育成苗的過程中，jai1-1突變體生長較慢，植株瘦小細(xì)長，葉片小且薄，植株能夠正常開花但不能正常結(jié)實，有極少數(shù)能夠正常結(jié)實的其果實也比野生型小很多，且沒有正常的種子。以本實驗探索得到的番茄最佳離體再生體系為基礎(chǔ)，可以將COI基因引入到番茄育種中，提高番茄品種對生物脅迫和非生物脅迫的抗性。下一步將以jai1-1突變體為材料，對番茄茉莉酸甲酯受體基因COI以及JA的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進(jìn)行深入研究。

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